郭旭，陳乃東

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012；2.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽六安237012；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)士官學(xué)校，河北石家莊050051）

商陸（Phytolacca acinosa Roxb.）為商陸科植物商陸和垂序商陸的根，主產(chǎn)于河南、安徽、湖北等地。商陸味苦，性寒，有毒；歸肺、脾、腎、大腸經(jīng)，逐水消腫，通利二便，解毒散結(jié)，用于水腫脹滿，二便不通，治癰腫瘡毒[1]，為歷版中國(guó)藥典收載。現(xiàn)代藥理研究表明，商陸富含多糖等化學(xué)成份[2-4]，具促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生白介素-2、誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白介素-1、抗腫瘤等作用[5-11]。

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是一種應(yīng)用較廣的試驗(yàn)優(yōu)化方法，由于采用了更為合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以最為經(jīng)濟(jì)的方式對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行全面研究，可高效快速地確定多因子系統(tǒng)中最佳因子組合。本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法從提取時(shí)間、提取溫度、液料比三方面對(duì)商陸總多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為商陸質(zhì)量評(píng)價(jià)與資源開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料2016年11 月采自皖西學(xué)院藥用植物園，品種經(jīng)陳乃東教授鑒定為商陸（Phytolacca acinosa Roxb.）。新鮮的商陸根，洗凈，-50 ℃冷凍干燥至恒重，粉碎，過(guò)40 目篩，備用。

蒽酮：上海科豐實(shí)業(yè)有限公司；硫酸、三氯甲烷：西隴科學(xué)股份有限公司；D（+）-葡萄糖：廣州萬(wàn)從化工有限公司；正丁醇：天津博迪化工股份有限公司；無(wú)水乙醇：上海振興化工一廠。以上均為國(guó)產(chǎn)分析純。

電子天平（FA-1004 型號(hào)）：上海精科天平廠；立式高速冷凍離心器（HR/T20MN）：湖南赫西儀器裝備有限公司；雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000）：上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 商陸多糖的提取

精確稱取商陸粉末約2 g，按設(shè)定液料比、提取溫度、提取時(shí)間提取后過(guò)濾獲總多糖提取液。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及以葡萄糖計(jì)多糖含量測(cè)定

精確配制0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液，精密量取 0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 7 支帶塞刻度試管中，分別加雙蒸水至體積為1.0 mL，搖勻，于冰水浴中緩慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，搖勻，冷卻后，100.0 ℃水浴中水浴10.0 min 后取出，冷卻至20 ℃，以雙蒸水為空白對(duì)照，于620 nm 下測(cè)吸光度值，得吸光度與濃度的回歸方程a=8.256 7x+0.026 2，R2=0.990 1，在0～0.1 mg，吸光度（a）與濃度（x）呈良好的線性關(guān)系。

精密量取1.2.1 制備的總多糖提取液1.0 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測(cè)吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出以葡萄糖計(jì)商陸多糖含量。

1.2.2.2 換算因子的測(cè)定及多糖含量的測(cè)定

將1.2.1 制備的總多糖提取液適當(dāng)濃縮，經(jīng)醇沉、反復(fù)Sevage 法脫蛋白[12-15]至無(wú)明顯中層后，收集上部水層，-50 ℃冷凍干燥獲精制多糖。

精密稱取精制多糖10.0 mg，置100 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，精密吸取1.0 mL，按1.2.2.1 所述方法測(cè)定其吸光度，按下式計(jì)算換算因子（F）：

式中：W 為精制多糖質(zhì)量，mg；C 為多糖液中葡萄糖折合濃度，mg/mL；D 為稀釋因素。

本試驗(yàn)條件下測(cè)得F=1.762 8。

將1.2.2.1 測(cè)定的以葡萄糖計(jì)多糖含量乘以換算因子，獲商陸多糖含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

將不同提取條件下測(cè)得商陸多糖的含量作為商陸多糖提取率，分別考察提取溫度、液料比、提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。試驗(yàn)方案如下：

保持液料比 50∶1（mL/g）、提取時(shí)間 3 h，研究提取溫度 40、55、70、85、100 ℃對(duì)多糖提取的影響。

保持溫度70 ℃、提取時(shí)間3 h，考察液料比10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1（mL/g）對(duì)多糖提取的影響。

保持溫度 70 ℃、液料比 50∶1（mL/g），考察提取時(shí)間為 1、2、3、4、5 h 對(duì)多糖提取的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，基于Box-Behnken 設(shè)計(jì)思路，運(yùn)用Design-Expert 8.05b 軟件，分別以A 液料比、B 提取溫度、C 提取時(shí)間 3 個(gè)因素，以-1、0、1 表示其 3個(gè)水平（表1），多糖提取率為響應(yīng)值，開(kāi)展響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝。

表1 響應(yīng)面法試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以商陸多糖提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用Design-Expert 8.05b 軟件分析測(cè)得的數(shù)據(jù)，確定商陸多糖的最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

由圖 1a 可見(jiàn)，當(dāng)液料比為 10∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）時(shí)，隨著液料比增加，多糖的提取率迅速增加，當(dāng)液料比超過(guò)70∶1（mL/g）時(shí)，多糖提取率增長(zhǎng)緩慢?？紤]液料比增加，后處理越費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，從簡(jiǎn)化工業(yè)生產(chǎn)后處理角度出發(fā)，試驗(yàn)選擇液料比 30∶1（mL/g）～70∶1（mL/g）作為進(jìn)一步響應(yīng)面法優(yōu)化的液料比范圍。

圖1 液料比、提取溫度與提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響Fig.1 The effects of liquid material ratio，extracting temperatures and extracting time on the yield of polysaccharide

從圖1b 可見(jiàn)，提取溫度對(duì)商陸多糖提取有明顯影響，當(dāng)溫度由 40 ℃升為 55 ℃、85 ℃升為 100 ℃，提取率增長(zhǎng)緩慢；當(dāng)溫度從55 ℃升至85 ℃，多糖的提取隨溫度的增高迅速上升，因此，試驗(yàn)選擇提取溫度55 ℃～85 ℃作為進(jìn)一步響應(yīng)面法優(yōu)化的溫度范圍。

由圖1c 可見(jiàn)，當(dāng)提取時(shí)間由1 h 延長(zhǎng)為2 h 時(shí)，多糖的提取率13.5%增加到14.1%，當(dāng)提取時(shí)間由2 h 增加到4 h 時(shí)，多糖提取率由14.1%迅速增加到20.1%，4 h 后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，提取率增加緩慢，因此，試驗(yàn)選擇提取時(shí)間2 h～4 h 作為進(jìn)一步響應(yīng)面法優(yōu)化的提取時(shí)間范圍。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

采取Box-Behnken 軟件對(duì)單因素試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計(jì)量分析，最終得到最佳的試驗(yàn)結(jié)論。表2 為通過(guò)軟件分析之后得到的對(duì)商陸多糖提取的三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)及各試驗(yàn)條件下的商陸多糖提取率。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface methodology

2.2.2 回歸方程方差分析

依據(jù)表2 的結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.5b 進(jìn)行回歸分析，得到商陸多糖提取率（Y）與料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）多元非線性回歸方程：

Y=-11.5+0.2A+0.2B+10.8C+0.002AB+0.05AC+0.03BC-0.004A2-0.003B2-2.4C2

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)、方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Significant test for regression model

續(xù)表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Significant test for regression model

由表3 可見(jiàn)，該模型極顯著（F 值=8.63，P＜0.01），且失擬項(xiàng)（P=0.024 3）不顯著，說(shuō)明該回歸方程擬合度好，受其它因素影響較小，可以用來(lái)預(yù)測(cè)商陸多糖的最佳提取工藝。此外，液料比的一次項(xiàng)（A）與二次項(xiàng)（A2）、提取時(shí)間的二次項(xiàng)（C2）極顯著（P＜0.01），提取溫度的一次項(xiàng)（B）與二次項(xiàng)（B2）、提取時(shí)間的一次項(xiàng)（C）、液料比與提取溫度的二次交互項(xiàng)（AB）、提取溫度與提取時(shí)間的二次交互項(xiàng)（BC）均顯著（P＜0.05），且各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由顯著性檢驗(yàn)中的決定系數(shù)R2=0.957 3，校正系數(shù)R2Adj=0.911 5可知，該模型中的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相關(guān)性較高，并且能較好地反映出各個(gè)因素對(duì)商陸多糖提取率的影響。通過(guò)對(duì)上表的數(shù)學(xué)方差的統(tǒng)計(jì)和定量的分析，可以看出，各單因素對(duì)于多糖提取率的影響程度從大到小依次為液料比、提取時(shí)間、提取溫度。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖，可以更加直觀地反映出各單因素對(duì)多糖提取的影響結(jié)果以及各單因素之間交互影響的強(qiáng)弱關(guān)系。液料比、提取時(shí)間、提取溫度這3 個(gè)因素兩兩交互作用的三維響應(yīng)面與等高線圖見(jiàn)圖2。通過(guò)響應(yīng)面圖可知，在所對(duì)應(yīng)的范圍內(nèi)存在極大值，即為各響應(yīng)面的最高點(diǎn)，亦為等高線最內(nèi)橢圓的中心點(diǎn)。

圖2 兩兩因素交互作用對(duì)多糖提取的影響Fig.2 Interactive effects of three factors on extracting polysaccharide

從圖2a 可知，液料比與提取時(shí)間對(duì)商陸多糖提取率的交互作用顯著，當(dāng)液料比為 60∶1（mL/g）、提取時(shí)間為3.5 h 時(shí)，多糖提取率最高，從等高線圖亦可以看出，提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響更大。

從圖2b 可知，液料比與提取溫度對(duì)商陸多糖提取率的交互作用顯著，多糖提取率在液料比60∶1（mL/g）、提取溫度70 ℃時(shí)達(dá)到最高，等高線曲線斜率反映出提取溫度對(duì)多糖提取率影響更明顯。

從圖2c 可知，提取溫度與提取時(shí)間對(duì)商陸多糖提取率的交互作用顯著，提取溫度對(duì)多糖的影響占主導(dǎo)。在溫度70 ℃、提取時(shí)間3.5 h 時(shí)，多糖提取率較高。

綜合Design-expert 軟件分析結(jié)果可以得出，商陸多糖最佳提取工藝為：液料比 60∶1（mL/g）、溫度 70 ℃提取3.5 h 時(shí)，理論上此條件下多糖提取率為21.38%。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了對(duì)最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，在液料比60∶1（mL/g）、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間3.5 h 下進(jìn)行3 組平行重復(fù)試驗(yàn)，最終得到的商陸多糖的提取率為21.65%，與預(yù)測(cè)值的相差為1.26%，差異較小。故利用響應(yīng)面優(yōu)化提商陸多糖得到的提取工藝真實(shí)可靠，明顯高于魯建江等采用微波提取測(cè)定的19.061%[16]，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法，對(duì)液料比、提取時(shí)間、提取溫度這3 個(gè)因素進(jìn)行考察，并采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果得出，液料比、提取時(shí)間與提取溫度對(duì)多糖提取率影響顯著，其影響順序?yàn)椋阂毫媳龋咎崛r(shí)間＞提取溫度。通過(guò)二次回歸方程，得到的最優(yōu)提取工藝為液料比 60∶1（mL/g）、提取時(shí)間 3.5 h、提取溫度70 ℃，商陸多糖的實(shí)際平均提取率為21.65%。