鄧國雄 韋金儒 陳梅香

[摘要]目的 探討艾塞那肽對(duì)同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）損傷的影響。方法 采用Hcy誘導(dǎo)HUVECs建立炎癥損傷模型，分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、模型組（200 μmol/L Hcy）、艾塞那肽低劑量組（200 μmol/L Hcy，EXE-L 5 nmol/L）、艾塞那肽中劑量組（200 μmol/L Hcy，EXE-M 10 nmol/L）、艾塞那肽高劑量組（200 μmol/L Hcy，EXE-H 20 nmol/L）。檢測(cè)各組的細(xì)胞生存活性，比較各組的一氧化氮（NO）含量、白介素-6（IL-6）水平、細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）水平、內(nèi)皮素-1（ET-1）水平、抑制蛋白κB-α（IκBα）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB） p65蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組的細(xì)胞生存活性、NO含量、IκBα蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，IL-6、ICAM-1和ET-1水平及NF-κB p65蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;艾塞那肽各組的細(xì)胞生存活性、NO含量、IκBα蛋白表達(dá)均明顯高于模型組，IL-6、ICAM-1和ET-1水平及NF-κB p65蛋白表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 艾塞那肽通過抑制炎癥反應(yīng)改善Hcy誘導(dǎo)的HUVECs損傷。

[關(guān)鍵詞]艾塞那肽;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;同型半胱氨酸;一氧化氮

[中圖分類號(hào)] R33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）6（a）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the influence of Exenatide on homocysteine （Hcy） -induced injury in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）. Methods Hcy-induced HUVECs were used to establish an inflammatory injury model， which were divided into the normal group， the model group （200 μmol/L Hcy）， the low dose of Exenatide treatment group （200 μmol/L Hcy， ExE-L 5 nmol/L）， the medium dose of Exenatide treatment group （200 μmol/L Hcy， ExE-M 10 nmol/L）， the high dose of Exenatide treatment group （200 μmol/L Hcy， ExE-H 20 nmol/L）. The cell viability in each group was detected， and the content of nitric oxide （NO）， the level of interleukin-6 （IL-6）， the level of intercellular adhesion factor-1 （ICAM-1）， the level of endothelin-1 （ET-1）， the expression of inhibitor protein kappa B-alpha （IκBα） and nuclear factor-κB （NF-κB） p65 protein were compared. Results The cell viability， the content of NO and protein expression of IκBα in the model group were significantly lower than that in the control group， the supernatant levels of IL-6， ICAM-1 and ET-1 and protein expression of NF-κB p65 in the model group were significantly higher than those in the control group， with significant difference （P<0.05）. The cell viability， the content of NO and protein expression of IκBα in the each Exenatide group were significantly lower than those in the model group， the supernatant levels of IL-6， ICAM-1， ET-1 and the protein expression of NF-κB p65 in the each Exenatide group were significantly lower than those in the model group， with significant difference （P<0.05）. Conclusion Exenatide can improve Hcy-induced HUVECs， injuried through inhibiting inflammatory response.

[Key words] Exenatide; Human umbilical vein endothelial cells; Homosyteine; Nitric oxide

高同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia，HHcy）與心腦血管疾病的發(fā)病密切相關(guān)[1]。近年來的流行病學(xué)調(diào)查研究證實(shí)我國人群中HHcy總體患病率達(dá)27.5%，此類人群將面臨較高的心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[2]。糖尿病患者血漿中的HHcy濃度較正常人增高，高血糖合并HHcy更易誘發(fā)動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙，增加心血管疾病的發(fā)生[3-4]。艾塞那肽是胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑（glucagon like peptide 1 receptor agonist，GLP-1 RAs），臨床上主要用于2型糖尿病的治療。艾塞那肽除具有降糖、減輕體重、改善胰島素抵抗等作用外，還具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能作用，具體作用機(jī)制尚未完全明確[5-6]。目前，國內(nèi)外已有不少關(guān)于艾塞那肽對(duì)Hcy氧化損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的作用研究，但有關(guān)炎癥反應(yīng)的影響未見報(bào)道。本研究擬通過體外以Hcy誘導(dǎo)HUVECs炎癥損傷再予以艾塞那肽干預(yù)，探討其影響及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1試劑與耗材

HUVECs（上海中喬新舟生物公司），艾塞那肽和HHcy（Sigma，美國），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）;一氧化氮試劑盒（南京建成生物工程研究所），內(nèi)皮素（ET）-1、白介素6（IL-6）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）ELISA試劑（武漢華美生物工程有限公司），核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65抗體和抑制蛋白κB-α（IκBα）抗體（Abcam，美國）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HUVECs用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱，每2天換液1次，當(dāng)鏡下細(xì)胞密度達(dá)80%左右以適量胰酶消化、完全培養(yǎng)基適時(shí)終止，離心后按1∶2傳代。為排除血清干擾及各組細(xì)胞同步化，干預(yù)前各組換DMEM無血清培養(yǎng)液過夜。細(xì)胞分5組（各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），具體如下。①對(duì)照組：加DMEM無血清培養(yǎng)基;②模型組：加含200 μmmol/L Hcy的DMEM無血清培養(yǎng)基;③低劑量EXE組（EXE-L組）：加含5 nmol/L EXE的無血清DMEM培養(yǎng)基預(yù)孵育2 h后加Hcy 200 μmol/L;④中劑量EXE組（EXE-M組）：含10 nmol/L EXE的無血清DMEM培養(yǎng)基預(yù)孵育2 h后，加200 μmol/L Hcy共培養(yǎng);⑤高劑量EXE組（EXE-H組）：含20 nmol/L EXE的無血清DMEM培養(yǎng)基預(yù)孵育2 h后，加Hcy 200 μmol/L共培養(yǎng)。以上五組處理后置入細(xì)胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)48 h。

1.3 HUVECs生存活性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期的HUVECs按1×104/孔接種于96孔板中，分組處理同前述“1.2”，把各孔原培養(yǎng)基吸棄后分別加入100 μl含CCK-8試劑的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h，以酶標(biāo)儀450 nm波長測(cè)定各組OD值。根據(jù)各組OD值與對(duì)照組比較作統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 IL-6、ICAM-1和ET-1含量的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長期的HUVECs接種于96孔板中，分組處理同前述“1.2”，收集各組細(xì)胞上清液，轉(zhuǎn)移于無菌EP（1.5 ml）中，上清液按3000 r/min（半徑r=8.4 cm）離心3 min后。用夾心法ELISA檢測(cè)細(xì)胞各組上清液的IL-6、ICAM-1和ET-1含量（操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行）。

1.5一氧化氮（NO）含量的測(cè)定

HUVECs種植于6孔板培養(yǎng)皿中，分組處理同前述“1.2”，吸取各組上清液，離心機(jī)5000 r/min（r=8.4 cm）離心，5 min后收集上清液作待測(cè)樣本，使用硝酸還原法進(jìn)行測(cè)定（具體操作按試劑盒說明）。

1.6蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)ⅠκBα和NF-κB p65蛋白的表達(dá)

HUVECs接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分組處理同前述“1.2”。收集各組細(xì)胞加裂解液，低溫裂解后離心取上清、蛋白定量，各組取等量樣品上樣，依次進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜，BSA液封閉后適當(dāng)洗膜，4℃低溫一抗孵育過夜后，TBST液充分洗膜，二抗孵育1 h，充分洗膜后暗室內(nèi)顯影，以β-actin作內(nèi)參，取各組目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差，方差齊使用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊改用Dunnett′s T3法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同處理對(duì)HUVECs生存活性和NO含量的影響

模型組的細(xì)胞生存活性和NO含量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;EXE-L組、EXE-M組和EXE-H組的細(xì)胞生存活性和NO含量顯著高于模型組（P<0.05或P<0.01）（表1）。

2.2不同處理對(duì)HUVECs分泌IL-6、ICAM-1和ET-1水平的影響

模型組的IL-6、ICAM-1和ET-1水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;EXE-L組、EXE-M組和EXE-H組的IL-6、ICAM-1和ET-1水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）（表2）。

2.3不同處理對(duì)HUVECs表達(dá)IκBα和NF-κB p65蛋白的影響

模型組的IκBα蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，EXE-L組、EXE-M組和EXE-H組的IκBα蛋白表達(dá)顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01或P<0.001）;模型組的NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，EXE-L組、EXE-M組和EXE-H組的IκBα蛋白較模型組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.001）（圖1～2）。