張毅威， 桂林生， 郭文莉， 胡 言， 余橫偉， 楊武才， 昝林森， 趙春平

(西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

SH2B銜接因子蛋白l(Src homology 2 B adaptor protein 1，SH2B1)屬于SH2B接頭蛋白家族，該家族蛋白含有SH2和PH結構域[1]。SH2B1蛋白在小鼠的中樞神經和外周組織中廣泛表達，在脂肪和肌肉等組織中含量豐富[2]。研究發(fā)現(xiàn)SH2B1的SH2結構域能夠與多種生長因子受體或細胞因子結合，其中包括胰島素受體(IR)、IR底物(IRS)1和2、Janus激酶(JAK)1和2，參與多種激素和多個細胞因子的信號通路，從而在生長發(fā)育、食欲、體重、代謝平衡、免疫調節(jié)等發(fā)面發(fā)揮著重要作用[3]。

近年來，國內外在人和小鼠上開展了大量關于SH2B1基因功能的研究[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)完全敲除SH2B1基因的小鼠表現(xiàn)為胰島素抵抗、瘦素抵抗、脂肪代謝紊亂、葡萄糖耐受性喪失等一系列與肥胖癥相關的癥狀。如果讓SH2B1僅在小鼠神經組織中表達，則可逆轉這些肥胖相關的癥狀。如果讓SH2B1在神經組織中過表達，將明顯的緩解由HFD給藥所引起的瘦素抵抗和肥胖[2]。此外，Song等通過對SH2B1敲除小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)SH2B1缺失小鼠表現(xiàn)為代謝能力下降、生長發(fā)育遲緩、體型明顯變小、存活率降低、壽命變短等特征，表明SH2B1對代謝和生長亦有調控作用[1]。還有研究表明，SH2B1參與調控脂肪細胞分化，如果去除或者阻斷SH2B1的作用，將導致脂肪干細胞分化為成熟的脂肪細胞困難并妨礙脂肪細胞中脂質的累積，表明SH2B1在脂肪細胞分化和脂肪沉積中發(fā)揮著作用[5-6]。SH2B1基因內的多個SNP位點與肥胖密切相關。在人上，SH2B1基因上的5個完全連鎖的SNP與腰圍、體重、血清瘦素水平和體內脂肪含量等顯著相關[7]。目前在家畜上也開展了SH2B1基因相關的研究。在探討SH2B1基因在牛生長發(fā)育等方面的作用中，楊明娟等分析了SH2B1基因在南陽牛等群體中的遺傳變異及其與生長性狀的關系，發(fā)現(xiàn)SH2B1基因第2 795 bp處存在G>A的錯義突變，導致相應的氨基酸由Ala突變?yōu)門hr。關聯(lián)分析顯示，該突變位點與生長性狀顯著相關，認為該基因可作為南陽牛體尺、體重和日增重選擇的分子育種候選標記[8]。

鑒于SH2B1基因在肥胖癥、脂肪代謝、生長發(fā)育中的重要作用，為深入探討該基因在中國黃牛的組織表達規(guī)律和遺傳多態(tài)性，本研究擬分析SH2B1基因在秦川牛不同組織中的相對表達量；此外，以4個中國地方黃牛品種為研究對象，包括秦川牛、郟縣紅牛、巴山牛和南陽牛，檢測SH2B1基因在4個黃牛群體中的多態(tài)性，并分析不同基因型對秦川牛體尺性狀的影響，以期為深入研究SH2B1的功能及分子標記輔助選擇打下了基礎，為秦川牛選育改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集3頭2周歲秦川牛的6種組織，包括腎臟、肝臟、背最長肌、小腸、脂肪、心臟。采集18～24月齡的4個地方黃牛品種共1 062頭的血樣，包括秦川牛476頭、郟縣紅牛335頭、巴山牛142頭、南陽牛109頭。對秦川牛進行體尺測量，測定性狀包括體長(BL)、體高(WH)、腰高(HH)、臀長(RL)、坐骨端寬(HW)、胸深(CD)、胸圍(CC)[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取和組織表達的分析 采用TRIZOL試劑盒提取總RNA，再經過反轉錄得到cDNA[9]。利用實時熒光定量PCR儀檢測基因表達。反應體系總體積為20 μL，包括：2.0 μL cDNA(50 ng)，0.8 μL上、下游引物(0.4 μmol/L)，10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，0.4 μL ROX reference dye和6 μL水。具體擴增步驟為：95 ℃，30 s；然后95 ℃，5 s，40個循環(huán)；最后60 ℃，45 s。每個樣品重復3次，β-actin作為內參基因，采用2-ΔΔCt方法計算SH2B1基因的相對表達水平[10]。

1.2.2 基因組DNA的提取及檢測 本試驗采用血液基因組DNA提取試劑盒提取包括秦川牛在內的共1 062頭的血樣基因組DNA，提取后的 DNA用TE緩沖液溶解，采用0.5 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，測定DNA濃度后，-20 ℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3 引物設計合成及PCR擴增 參照GeneBank中公布的牛SH2B1的序列(AC_000182.1)，利用Primer 5.0軟件設計引物見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，PCR反應體系30 μL，包括：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0 μL，dd H2O 11.8 μL，10.0 μmol/L混合引物(上游引物和下游引物各10.0 pmol/μL)1.2 μL，模板DNA(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃，30 s，最適溫度退火30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

表1 牛SH2B1基因引物序列及相關信息

1.2.4 數據統(tǒng)計與分析 運用遺傳多樣性分析軟件(Genpop 32)統(tǒng)計各突變點的等位基因頻率和基因型頻率，同時計算多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(Ne)、遺傳雜合度(He)和遺傳純合度(Ho)。使用SPSS 16.0軟件對不同位點基因型的分布進行Hardy-Weinberg平衡適應性檢驗[11]。

利用SPSS 19.0軟件檢驗各基因座位的基因型頻率和秦川牛的體尺性狀指標的關聯(lián)性，數學模型為：

Yijm=μ+Gi+Aj+Sm+Eijm

(1)

式中：Yijlm為每頭牛測量的性狀；μ為性狀的平均值；Gi為與基因型相關固定效應；Ai為由于年齡造成的固定效應；Sm為父本的固定效應；Eijlm為隨機誤差[12]。

2 結果與分析

2.1 SH2B1基因PCR擴增片段測序結果

牛SH2B1基因位于25號染色體上，基因全長8 550 bp，含8個外顯子。參考NCBI數據庫中GenBank公布的牛SH2B1基因序列(AC_000182.1)，對測序結果進行DNA序列比對和突變位點分析，共檢測到2個SNP位點，分別是在擴增序列的第6 073位處發(fā)生一處單堿基C>T的突變(圖1)，該SNP位于SH2B1基因第4內含子區(qū)域；另外在序列第8 067位發(fā)生一處T>C突變(圖2)，該SNP位于SH2B1基因的3′UTR區(qū)域。

圖1 多態(tài)位點C6073T序列圖

圖2 多態(tài)位點T8067C序列圖

2.2 秦川牛SH2B1基因mRNA的組織表達分析

SH2B1基因在秦川牛6種組織中表達情況分析結果見圖3。從圖3可以看出，SH2B1基因在各組織中呈泛表達狀態(tài)，表明該基因在體組織中分布廣泛，其表達量從高到低依次為心臟、背最長肌、腎臟、脂肪、肝臟、小腸。

圖3 秦川牛SH2B1基因mRNA的組織表達分析

2.3 SH2B1基因多態(tài)位點的遺傳學分析

4個黃牛群體中SH2B1基因2個多態(tài)位點的基因頻率和遺傳多態(tài)性統(tǒng)計結果見表2。由表2可知，秦川牛群體中，SNP1和SNP2位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。在SNP1位點上，C和T等位基因的頻率分別為67.86%和32.14%；CC、CT、TT基因型頻率分別為48.32%，39.08%，12.61%；基因雜合度和有效等位基因分別是0.436 2和1.773 8。在SNP2位點上，T和C等位基因頻率分別為78.36%和21.64%；TT、TC、CC等位基因頻率分別為63.03%，30.67%，6.30%；基因雜合度和有效等位基因分別為0.339 1和1.513 1。秦川牛群體中SH2B1基因在2個SNPs位點多態(tài)信息含量分別為0.341 1和0.281 6，均屬于中度多態(tài)。

郟縣紅牛群體中，SH2B1基因在第1個多態(tài)位點有3種基因型，即CC、CT和TT，他們的頻率分別為57.01%，32.24%，10.75%，等位基因C和T的頻率分別為73.13%和26.87%。該位點的多態(tài)信息含量、基因雜合度和有效等位基因數分別為0.315 8，0.393 0，1.647 3。因為0.25

巴山牛群體中，在SNP1上，C和T等位基因的頻率分別為69.37%和30.63%，CC、CT、TT基因型頻率分別為51.41%，35.92%，12.68%；在SNP2上，T和C等位基因頻率分別為76.76%和23.24%，TT、TC、CC基因型頻率分別為65.49%，22.54%，11.97%；巴山牛群SH2B1基因在2個SNPs位點的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.334 7和0.293 1，皆屬于中度多態(tài)。在第1個多態(tài)位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在第2個多態(tài)位點處于Hardy-Weinberg極不平衡狀態(tài)(P<0.01)。2個SNP位點的基因雜合度和有效等位基因數分別為0.425 0，1.739 1和0.356 8，1.554 7。

南陽牛群體中，在SNP1上，CC、CT、TT基因型頻率分別為48.62%，32.11%，19.27%；在SNP2上，TT、TC、CC基因型頻率分別為59.63%，32.11%，8.26%。Hardy-Weinberg的結果與巴山牛不同，在第1個多態(tài)位點處于Hardy-Weinberg極不平衡狀態(tài)(P<0.01)，而在第2個多態(tài)位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。南陽牛群SH2B1基因在2個SNPs位點的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.352 5和0.300 3，皆屬于中度多態(tài)。在SNP1，基因雜合度和有效等位基因分別是0.456 9和1.841 3，而在SNP2，這兩項指標分別為0.368 0和1.582 3。

表2 SH2B1基因各多態(tài)位點在4種黃牛群體的基因型頻率

2.4 SH2B1基因2個多態(tài)位點突變與秦川牛體尺性狀的相關性分析

對秦川牛的7個體尺性狀進行測定，并對SH2B1基因2個多態(tài)位點不同基因型與體尺性狀進行關聯(lián)分析，結果(表3)表明，在C6073T多態(tài)位點，CC型個體(n=230)在體長(BL)、腰高(HH)、坐骨端寬(HW)都顯著優(yōu)于TT型(P<0.05)，而CC個體和TT型個體之間，胸圍(CC)差異極顯著(P<0.01)。此外，TT個體的坐骨端寬(HW)與其他個體之間差異也顯著(P<0.05)，顯著小于CC和CT型。

對秦川牛的第2個多態(tài)位點(T8067C)和不同基因型之間進行關聯(lián)性分析，分析結果(表3)表明，TT型個體在體長(BL)這項指標與TC型(n=146)差異不顯著，但CC型個體(n=30)與其他個體之間差異極顯著(P<0.01)；體高(WH)這項指標，TT型與TC型個體對CC型個體差異顯著(P<0.05)，CC型個體與其他個體間差異極顯著(P<0.01)。

表3 秦川牛SH2B1基因各多態(tài)位點不同基因型與體尺性狀的關聯(lián)分析

注：同列數據后標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列數據后標注不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。BL(體長)，WH(體高)，HH(腰高)，RL(臀長)，HW(坐骨端寬)，CD(胸深)，CC(胸圍)。

3 討 論

SH2B銜接因子蛋白l是一種信號分子，參與多種信號傳導，在體內能量代謝調節(jié)等過程中發(fā)揮著重要的作用。細胞實驗表明，SH2B1基因可以參與生長激素誘導的JAK2活化、延緩IR酪氨酸及IRS的去磷酸化、增強IRS的磷酸化[6,13-14]。SH2B1敲除鼠的實驗表明，SH2B1對血糖、血脂、肥胖、胰島素、瘦素等具有重要的調節(jié)作用[15-16]。楊明娟等分析了SH2B1基因在中國黃牛群體中的遺傳變異及其與生長性狀的關系，發(fā)現(xiàn)SH2B1基因上存在的錯義突變與生長性狀顯著相關，認為該基因可作為中國黃牛生產性狀的分子育種候選標記[8]。因此，本試驗研究了秦川牛、郟縣紅牛、巴山牛和南陽牛4個中國地方品種SH2B1基因的多態(tài)性，在該基因的第4內含子和3′UTR共發(fā)現(xiàn)了2個多態(tài)位點，即C6073T和T8067C，這2個多態(tài)位點處于中度多態(tài)，因此，在生產中可以對SH2B1基因進行進一步加強選擇。進行卡方檢驗之后發(fā)現(xiàn)在C6073T多態(tài)位點上郟縣紅牛和南陽牛均處于Hardy-Weinberg極不平衡狀態(tài)，這可能是經過了長期選育以后造成的基因頻率的改變，也有可能是牛品種自身的原因，還有可能是不同地區(qū)人為對牛性狀的不同選育而造成的；相反巴山牛和秦川牛處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明在人工選育、遷徙和遺傳漂變等外界因素作用下，這個C6073T多態(tài)位點的基因型處于動態(tài)平衡中[8]。

經過長期選育以后，秦川牛等地方牛品種的生產性能得到了快速提高。此外，加大對特定基因的選擇強度必定成為提高秦川牛以及其他地方黃牛生產性狀的一個有效手段。SH2B1基因各突變位點不同基因型與秦川牛體尺的關聯(lián)性分析表明：C6073T位點與秦川牛的體長、髖高、坐骨端寬顯著相關，對秦川牛的胸圍影響極顯著。而T8067C位點對于秦川牛體長，體高影響顯著，并且T8067C的顯性純合子相對于雜合子在體高方面影響顯著。通過對C6073T和T8067C 2個多態(tài)位點有關于體長、體高、髖高、臀長、坐骨端寬、胸深、胸圍的體尺相關性分析后，筆者認為，SH2B1基因可能是影響秦川牛體長的主效基因或與之緊密連鎖，可以嘗試把SH2B1基因作為秦川牛新品系培育的輔助選擇分子標記。

測序和序列比對表明，2個SNPs位于內含子區(qū)域和3′UTR區(qū)域，并未改變其編碼的蛋白質的結構。然而，最近的研究提供的證據表明，在3′UTR的基因突變可能通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯，從而有可能影響蛋白表達及表型[17-19]。例如，牛NUCB2基因上的2個無意突變與秦川牛和南陽牛的體尺及生長性狀顯著相關[20]，OBR基因內含子8上的2個多態(tài)位點與肉雞的腹脂重和腹脂率顯著相關[21]，PAX3基因內含子上的1個SNP與草原紅牛和南陽牛的體長和體高相關[22]。本研究發(fā)現(xiàn)SH2B1基因的內含子區(qū)域和3′UTR區(qū)域的突變，與秦川肉牛的體尺性狀顯著相關，筆者推測這2個SNP位點可能對SH2B1蛋白表達、折疊或功能具有一定的影響。

在對秦川牛的不同組織進行了實時定量PCR分析后，筆者發(fā)現(xiàn)SH2B1基因在各組織中廣泛表達，表達量最高的組織是背最長肌和心臟組織，在小腸中表達量最少，在腎臟、肝臟與脂肪組織中表達量中等，這一結果表明該基因在牛組織中的表達情況和人上的類似[2]，即在許多組織中廣泛表達，這也與SH2B1參與多種信號途徑傳遞的功能相一致。

本試驗只對秦川牛SH2B1基因與體尺指標做了相關性分析，并沒有對郟縣紅牛、巴山牛和南陽牛SH2B1基因對于體尺指標進行相關性分析，所以在秦川牛身上得出的結論是否可以推廣到其他3個地方品種的育種方面，還有待進一步研究。

4 結 論

研究通過qPCR，對SH2B1基因在不同組織中的表達進行分析，并利用DNA測序技術在4個黃牛群體中檢測了SH2B1基因的多態(tài)性，結果表明該基因在秦川牛各組織中廣泛表達。此外在SH2B1基因的第4內含子和3′UTR各發(fā)現(xiàn)了1個單核苷酸多態(tài)位點，分別是C6073T和T8067C，并分析了這2個多態(tài)位點在4個黃牛群體中的等位基因頻率、多態(tài)信息含量、基因雜合度、有效等位基因數，進行了哈溫伯格平衡檢驗。在秦川牛群體中，就SH2B1基因各多態(tài)位點不同基因型與體尺性狀進行關聯(lián)型分析，結果表明這2個位點與秦川牛某些體尺性狀有顯著相關性。因此，SH2B1基因可以作為影響秦川牛生產性狀的遺傳標記候選基因。