王嶸 李衛(wèi)華

摘要 以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為供試菌種，研究了不同提取溫度、時(shí)間對(duì)竹屑提取物抑菌效果的影響，考察了不同水解條件下還原糖的得率，初步分析了還原糖的種類。結(jié)果表明，以95%乙醇為提取劑，在溫度為50 ℃下加熱回流提取2.5 h得到的竹屑提取物的抑菌效果最好，總黃酮得率也最高（0.86%），說明總黃酮可能是竹屑提取物中主要的抑菌活性成分;竹屑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為0.062 5、0.031 3、0.125 0 g/mL;在115 ℃下用4.5%稀硫酸水解1.5 h，總還原糖得率最高（66.57%）;色譜分析表明，竹屑水解后的主要還原糖有阿拉伯糖、果糖、葡萄糖。

關(guān)鍵詞 竹屑; 提取物;抑菌活性;水解;還原糖

中圖分類號(hào) TQ914.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）15-0064-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract The effects of extraction time and temperature on antibacterial activities of the extract from bamboo chips against Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were tested. The yield of reducing sugar under different hydrolysis conditions was studied， and species of reducing sugar were analyzed.The results indicated that the extract from bamboo chips extracted for 2.5 h under 50 ℃ using 95% ethyl alcohol had the best antifungal activity and the highest yield （0.86%）of general flavone，which implied that general flavone could be the main antibacterial activity ingredients in bamboo chips extract.Minimum inhibition concentration（MIC） of the bamboo chips extract was 0.062 5， 0.031 3 and 0.125 0 g/mL for S.aureus，B.subtilis and E.coli，respectively. Bamboo chips hydrolyzed for 1.5 h under 115 ℃ using 4.5% sulphuric acid solution， the yield of total reducing sugars was the highest（66.57%）. Chromatographic analysis indicated that the main reducing sugars were arabinose， fructose and glucose.

Key words Bamboo chips;Extract;Antibacterial activity;Hydrolysis;Reducing sugar

基金項(xiàng)目 安徽省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（1704a0902006）。

作者簡(jiǎn)介 王嶸（1989—），女，安徽合肥人，助教，碩士，從事固體廢物處理與利用研究。*通信作者，教授，博士，從事廢水生物處理及其反應(yīng)過程的分子光譜解析研究。

收稿日期 2019-04-25

我國(guó)有豐富的竹類資源，素有“竹子王國(guó)”之稱，現(xiàn)有竹類植物42個(gè)屬，500多個(gè)種，竹林面積421萬(wàn)hm2[1]，無(wú)論是竹種資源、竹林面積，還是竹林蓄積產(chǎn)量均居世界首位。竹子廣泛應(yīng)用于建筑、家具、炭、制漿造紙及紡織等行業(yè)。目前，我國(guó)竹子采伐后，大量竹葉和竹竿被廢棄，竹加工過程中產(chǎn)生的竹屑也被廢棄，竹材利用率平均不到50%，有的產(chǎn)品竹材利用率甚至不到20%[2]。竹加工廢棄物的資源化利用問題應(yīng)該受到重視。

從20世紀(jì)60年代開始，抗生素作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病防治[3]。然而動(dòng)物性產(chǎn)品中抗生素的殘留威脅了消費(fèi)者身體健康，同時(shí)也造成了環(huán)境中抗生素的殘留污染。開發(fā)綠色、無(wú)污染的飼料添加劑迫在眉睫。研究表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸類化合物、蒽醌類化合物、萜類內(nèi)酯和生物堿等都有著較強(qiáng)的抑菌殺菌作用[4]，竹提取物也具有廣譜抑菌活性[5]。因此，從竹加工廢棄物中提取活性物質(zhì)用于制備飼料添加劑值得研究[6]。竹屑中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量較高[7]，而纖維素和半纖維素在適當(dāng)條件下水解發(fā)酵可制備功能性低聚糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖等[8]，得到的糖還可進(jìn)一步生產(chǎn)燃料乙醇、木糖醇、糠醛等工業(yè)產(chǎn)品[9-12]。開展竹屑的水解制糖研究可以提高竹子資源的利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

筆者通過體外抑菌試驗(yàn)研究了不同提取條件下獲得的提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果，考察了不同水解條件下還原糖的得率，初步分析了還原糖的種類，以期為竹加工廢棄物的資源化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

竹屑樣品采自安徽省廣德縣某竹加工廠，竹屑樣品經(jīng)自然風(fēng)干后密封保存。試驗(yàn)用菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

1.2 藥品與試劑 葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、丙三醇、酒石酸鉀鈉、醋酸鈉、冰乙酸、乙腈、硫酸為分析純，蕓香葉苷、無(wú)水乙醇、纖維素酶、綠色木酶（≥15 000.0 U/g）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等。

1.3 儀器設(shè)備

EYEL4-N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗）;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（上海博訊）;AL104型電子天平（梅特勒）;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）;UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津）;Nicolet 8700型紅外光譜儀（美國(guó)熱電）。

1.4 方法

1.4.1 竹屑中抑菌活性物質(zhì)的提取條件。

以竹屑為原料，以95%乙醇為提取劑，固液比1∶10（g∶mL），通過抑菌圈試驗(yàn)，研究不同提取溫度和提取時(shí)間下提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

1.4.2 體外抑菌試驗(yàn)方法。

1.4.2.1 供試菌懸浮液制備[13]。從預(yù)先活化的菌種中分別挑取2環(huán)制成菌懸液，然后用無(wú)菌水稀釋至含菌體107～108 CFU/mL，即得供試菌懸液[14]，備用。

1.4.2.2 抑菌試驗(yàn)方法。在已滅菌的肉湯培養(yǎng)基平皿內(nèi)分別加0.1 mL菌懸液，涂布均勻，用打孔器打1個(gè)直徑6 mm圓孔，再用少量未冷卻的培養(yǎng)基填封孔底。冷卻后，圓孔加入0.5 g/mL竹提取物，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h取出，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.4.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定。用2倍稀釋法[15]將1.0 g/mL提取物逐級(jí)稀釋成不同濃度，在各平皿內(nèi)分別加入2 mL不同濃度的提取液，然后將已倒入15 mL經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)基充分混勻，冷卻凝固后，每皿加入0.1 mL菌懸液，涂布均勻，培養(yǎng)方法同上，以24 h不長(zhǎng)菌的提取液濃度為最小抑菌濃度，以上每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)[16-17]。

1.4.3 竹屑提取物中總黃酮含量的測(cè)定。提取物中總黃酮的測(cè)定采用文獻(xiàn)[18-19]的方法。

1.4.4 竹屑的水解方法。

1.4.4.1 硫酸水解法。稱取100.0 g竹屑樣品于具塞三角瓶中，按照固液比1∶10分別加入4.5%硫酸溶液或40%硫酸溶液，在115 ℃條件下水解1.5 h。

1.4.4.2 氫氧化鈉水解法。稱取100.0 g竹屑樣品于具塞三角瓶中，按照固液比1∶10分別加入20%或40%氫氧化鈉溶液，在120 ℃條件下水解45 min。

1.4.4.3 纖維素酶水解法。稱取100.0 g竹屑樣品于具塞三角瓶中，按照固液比1∶10加入酶活力≥15 000 U/g的纖維素酶緩沖溶液（pH=8），在120 ℃條件下反應(yīng)40 min。

1.4.5 水解液中總還原糖含量的測(cè)定?？傔€原糖測(cè)定采用DNS法[20]。

1.4.6 水解液中主要還原糖含量的測(cè)定。10 mL水解液中加入0.1 g經(jīng)處理后的活性炭，經(jīng)Sep PakC18小柱（1 g/6 mL）凈化后，采用HPLC法測(cè)定水解液中主要還原糖含量。測(cè)定條件如下：

高效液相色譜儀（Waters 600E）;色譜柱：Zorbax NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相∶乙腈/水=81∶19;流速1.0 mL/min;檢測(cè)器：蒸發(fā)光檢測(cè)器;進(jìn)樣體積10 μL。

1.4.7 竹屑紅外光譜的測(cè)定。將竹屑樣品與KBr一起進(jìn)行充分研磨，壓片后進(jìn)行紅外光譜測(cè)定[21]，波數(shù)范圍：400～4 000 cm-1，分辨率為（波數(shù)）1 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件下竹屑提取物對(duì)3種病原菌的抑菌效果

竹屑中的主要抑菌成分是多羥基類成分，包括多酚類、黃酮類、丹寧類等，植物中抗菌成分的含量、種類等除受遺傳因素、環(huán)境條件等的影響外，還與植株部位、采收時(shí)間等有直接關(guān)系[22]。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌為供試菌種，采用抑菌圈法對(duì)不同提取條件下提取物抑菌特性進(jìn)行研究。從圖1可以看出，以無(wú)水乙醇稀釋到95%乙醇為提取劑，不同提取條件下的竹屑提取物對(duì)3種病原菌都有一定的抑菌作用，但抑菌效果有差異。不同溫度下竹屑提取物對(duì)3種病原菌的抑菌效果從好到差依次為50、65、45、55、30 ℃。對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果較強(qiáng)的是50 ℃條件下竹屑提取物，抑菌圈直徑為17.20～27.30 mm，抑菌效果最差是30 ℃條件下竹屑提取物，抑菌圈直徑為7.50 mm左右。提取時(shí)間對(duì)提取物抑菌效果的影響沒有明顯的規(guī)律性?？傮w來說，對(duì)3種菌抑菌效果均較好的是在50 ℃條件下提取2.5 h的竹屑提取物。

2.2 竹屑提取物的最小抑菌濃度 在相同時(shí)間內(nèi)，竹提取物濃度越高，抑菌率越高;同一濃度的竹提取物，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑菌率越高[23-24]。為了了解竹屑提取物對(duì)3種細(xì)菌的最小抑菌濃度，采用二倍稀釋法將50 ℃條件下提取2.5 h的竹屑提取物稀釋不同倍數(shù)后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，觀察無(wú)菌生長(zhǎng)管所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。從表1可以看出，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對(duì)竹屑提取物的敏感性不同，竹屑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為0.062 5、0.031 3、0125 0 g/mL。

2.3 提取條件對(duì)提取物中總黃酮得率的影響

黃酮類化合物是自然界中存在的酚類物質(zhì)，屬植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，是自然界藥用植物中主要活性成分之一，具有抑菌和改善動(dòng)物生長(zhǎng)等作用[25]。以95%乙醇為提取劑，不同提取溫度和時(shí)間條件下竹屑提取物中總黃酮得率見表2。從表2可以看出，提取溫度在30～65 ℃，提取時(shí)間1.0～3.0 h，提取物中總黃酮得率為0.03%～0.86%，在提取溫度為30 ℃條件下，總黃酮得率為0.03%～0.05%，且不同的提取時(shí)間黃酮得率變化不大;提取溫度為45 ℃條件下，總黃酮得率為0.19%～044%，明顯高于30 ℃條件下;提取溫度為50 ℃條件下，提取物中總黃酮得率相對(duì)最高;提取溫度升高到55 ℃后，總黃酮得率略有下降，溫度從55 ℃升高到65 ℃后，總黃酮得率基本無(wú)變化。提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響程度低于提取溫度的影響。由此可見，以95%乙醇為提取劑，在50 ℃條件下提取2.5 h總黃酮得率最高（0.86%）。不同提取條件下竹屑提取物中總黃酮得率的變化規(guī)律與不同提取條件下竹屑提取物對(duì)3種病原菌的抑菌效果變化規(guī)律基本一致，說明總黃酮可能是竹屑提取物中主要的抑菌活性成分。

2.4 竹屑的水解研究

2.4.1 不同水解液對(duì)還原糖得率的影響。

竹屑中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量較高。纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，半纖維素主要由木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖組成，而纖維素和半纖維素在適當(dāng)條件下水解可制備木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，因此，開展了竹屑的水解研究，為竹屑的資源化利用提供參考。從圖2可以看出，竹屑經(jīng)硫酸溶液水解后還原糖得率明顯優(yōu)于氫氧化鈉溶液。硫酸溶液濃度對(duì)還原糖的得率影響較大，4.5%硫酸溶液水解后還原糖得率為66.57%，而40%硫酸溶液水解后還原糖得率為4230%。竹屑經(jīng)氫氧化鈉溶液水解后還原糖得率較低，且氫氧化鈉溶液的濃度對(duì)還原糖的得率影響不大，20%氫氧化鈉溶液和40%氫氧化鈉溶液水解后還原糖的得率分別為2760%和25.45%，竹屑經(jīng)纖維素酶水解后還原糖得率為55.30%，高于氫氧化鈉溶液水解，低于4.5%硫酸溶液水解的還原糖得率?？梢?，竹屑經(jīng)4.5%硫酸溶液水解后還原糖的得率最高。目前，纖維素的化學(xué)水解仍以酸為主，其他的水解方法尚在探索之中。

2.4.2 竹屑水解的主要產(chǎn)物。

竹屑中含有25%左右的半纖維素，在適當(dāng)條件下水解，可獲得果糖、阿拉伯糖、葡萄糖等，竹屑水解液中含有大量色素及膠質(zhì)，給直接進(jìn)樣分離測(cè)定帶來困難。該研究探討了試樣的凈化方法，水解液經(jīng)活性炭、Sep PakC18小柱凈化后，水解液無(wú)色透明，用HPLC測(cè)定各還原糖的含量。從圖3可以看出，竹屑水解后有4個(gè)還原糖產(chǎn)物，通過與標(biāo)準(zhǔn)還原糖色譜圖中各還原糖的保留時(shí)間比對(duì)，其中有3個(gè)還原糖分別是阿拉伯糖、果糖和葡萄糖，而Rt=8.2 min的還原糖尚未鑒定出是哪種糖。

2.4.3 竹屑水解前后紅外光譜比較。

由圖4可知，未水解的竹屑樣品紅外光譜圖中，3 424 cm-1附近的吸收峰是—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，是所有纖維素的特征譜帶， 2 903? cm-1附近的吸收峰歸屬為C—H的伸縮振動(dòng)峰，1 734? cm-1處的吸收峰是來自半纖維素中的乙?；Ⅴッ焰I吸收峰，1 056? cm-1附近吸收峰歸屬為C—O伸縮振動(dòng)峰或O—H的變形振動(dòng)峰，993? cm-1附近的吸收峰是纖維中醚鍵的特征峰[17]。竹屑經(jīng)酸堿水解后，3 424 cm-1吸收峰減小，2 903和1 734? cm-1處的吸收峰消失，說明纖維素和半纖維素全部或部分水解。在植物細(xì)胞壁中，半纖維素主要通過酯鍵同木素相連，因此這種破壞對(duì)于半纖維素和木素的溶出起到重要作用。993? cm-1處紅外吸收峰的強(qiáng)弱變化與纖維中醚鍵所處晶格變化有一定關(guān)系，經(jīng)酸堿處理后此處吸收峰減弱甚至消失，是由于纖維的纖維素晶格受到一定改變引起的。在所有處理中，經(jīng)4.5%硫酸溶液處理后的竹屑在1 734? cm-1處吸收峰最弱，表明經(jīng)4.5%硫酸溶液處理后的竹屑半纖維素結(jié)構(gòu)遭到破壞，這種破壞對(duì)半纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖起到了重要的作用。

3 結(jié)論

（1）通過體外抑菌試驗(yàn)，研究了竹屑提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果表明，竹屑的乙醇提取物對(duì)3種病原菌均有一定的抑菌作用，但提取溫度和時(shí)間對(duì)抑菌效果有一定的影響，在50 ℃條件下提取2.5 h得到的竹屑提取物對(duì)3種菌的抑菌效果最好，且該條件下總黃酮得率最高，說明總黃酮可能是竹屑提取物中抑菌活性成分之一。

（2）金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對(duì)竹屑提取物的敏感性不同，竹屑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為0.062 5、0.031 3、0.125 0 g/mL。

（3）竹屑經(jīng)硫酸溶液、氫氧化鈉溶液、纖維素酶水解后均可產(chǎn)生還原糖，還原糖得率從高到低依次為4.5%硫酸溶液、竹屑經(jīng)纖維素酶、40%硫酸溶液、20%氫氧化鈉溶液和40%氫氧化鈉溶液。色譜分析表明，竹屑水解的主要產(chǎn)物有阿拉伯糖、果糖和葡萄糖等。

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