董智勇 劉立芹 龔理 劉炳艦 江麗華 遲長鳳 呂振明

摘要 采用茜素絡(luò)合物、動物體內(nèi)色素標(biāo)簽及玻璃管動物標(biāo)簽3種方法對養(yǎng)殖條件下的曼氏無針烏賊幼體進(jìn)行標(biāo)志，探索其在今后烏賊野外標(biāo)志放流中的應(yīng)用可行性。結(jié)果表明，3種標(biāo)志方法均可有效運(yùn)用于曼氏無針烏賊幼體的標(biāo)志中。標(biāo)志后，茜素絡(luò)合物、動物體內(nèi)色素標(biāo)簽會在標(biāo)記處留下清晰可見的紫色或藍(lán)色斑塊，而玻璃管動物標(biāo)簽會在標(biāo)記處形成突出的隆起，3種標(biāo)志可從幼體階段一直持續(xù)到成體階段，標(biāo)志保存率均達(dá)100%。3種標(biāo)志對烏賊的活動、生長和存活均無顯著影響（P>0.05）。相對于茜素絡(luò)合物、動物體內(nèi)色素標(biāo)簽，玻璃管動物標(biāo)簽具有更高效的標(biāo)志效果，在今后曼氏無針烏賊大規(guī)模標(biāo)志放流中具有較大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞 曼氏無針烏賊;幼體;標(biāo)志方法

中圖分類號 S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0085-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract Alizarin complexone，animal pigment labeling and animal glass tube had been applied to tag S.japonica juveniles， to explore the feasibility of their application in futures tagging and releasing activity.The results showed that all three tagging methods could be effectively applied in S.japonica juveniles.Alizarin complexone，animal pigment labeling showed obvious purple or blue marks on tagged animals and animal glass tube tags resulted in an obvious back skin uplift that was easily recognized.All these markers lasted long from juvenile to adult stage after tagging，the tag retention rate was nearly 100% for all these three methods.Three tagging methods had no significant effect on the activity，growth and survival rate of S.japonica（P>0.05）.Compared with other two tagging methods，animal glass tube tags seemed more effective in tagging，and it have greater potential of application in futures tagging and releasing activity of this species.

Key words Sepiella japonica;Juvenile;Tagging methods

基金項(xiàng)目 浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目（2015C32027）。

作者簡介 董智勇（1982—），男，河北邯鄲人，碩士，從事養(yǎng)殖生物學(xué)與養(yǎng)殖工程技術(shù)研究。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究。

收稿日期 2019-05-06

曼氏無針烏賊（Sepiella japonica）是我國傳統(tǒng)的海洋漁業(yè)資源，廣泛分布于黃渤海、東海和南海海域[1]。在東海，曼氏無針烏賊歷史產(chǎn)量尤高，僅浙江省歷史最高年產(chǎn)量就超過6 t，占當(dāng)時浙江捕撈漁業(yè)總產(chǎn)量的9.3%，因而被譽(yù)為東海區(qū)“四大海產(chǎn)”之一[1]。但20世紀(jì)70年代末以來，由于過度捕撈和水域條件的破壞，我國曼氏無針烏賊漁業(yè)資源急劇衰退，目前已接近枯竭[2]。為快速恢復(fù)我國曼氏無針烏賊的自然資源，21世紀(jì)初我國逐步突破了曼氏無針烏賊的人工繁育技術(shù)，大規(guī)模的人工增殖放流和養(yǎng)護(hù)工作已在浙江、福建等省份逐步展開，并取得初步成效[3-4]。但由于缺乏有針對性的標(biāo)志放流技術(shù)體系，迄今我國仍未對多年來的增殖養(yǎng)護(hù)工作的實(shí)際效果進(jìn)行有效、準(zhǔn)確的評估，更無法提出科學(xué)的增殖工藝的優(yōu)化策略，因此建立適于曼氏無針烏賊標(biāo)志放流技術(shù)體系已勢在必行。

建立適宜的幼體標(biāo)志方法是構(gòu)建曼氏無針烏賊標(biāo)志放流技術(shù)體系的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)在海洋頭足類標(biāo)志方法方面的研究還非常薄弱[4-6]，但國外已在諸多海洋頭足類種類上開展了許多卓有成效的研究，建立了包括體外物理標(biāo)志[7-8]、化學(xué)標(biāo)志[9]、電子標(biāo)簽[10-11]在內(nèi)的多種頭足類標(biāo)志方法，并在多個頭足類種類的增殖群體跟蹤及效果評估方面開展了實(shí)際運(yùn)用[7，10]。大量研究表明，物理標(biāo)志法具有價格低廉、操作簡單等特點(diǎn)，適于頭足類大規(guī)模標(biāo)志放流，但同時也存在對標(biāo)志動物損傷較大、掉標(biāo)率較高、尺寸較大不適合幼體標(biāo)志等缺點(diǎn)，限制了其在頭足類上的應(yīng)用[12-13]。相對而言，化學(xué)標(biāo)志法具有低損傷、適于各個發(fā)育階段的頭足類、且一次性可大規(guī)模標(biāo)志數(shù)量眾多的個體[12];電子標(biāo)簽法同樣具有低損傷、可自動化識別、部分標(biāo)志方法可實(shí)現(xiàn)實(shí)時跟蹤等優(yōu)點(diǎn)[12，14]，因此是海洋頭足類更為理想的標(biāo)志方法。筆者嘗試采用2種化學(xué)標(biāo)志法和1種電子標(biāo)簽法對曼氏無針烏賊幼體進(jìn)行標(biāo)志，分析和比較它們的標(biāo)志效果及其對烏賊行為、生長、存活等的影響，旨在探索建立一種適于曼氏無針烏賊的標(biāo)志方法，為今后建立較為完善的曼氏無針烏賊標(biāo)志放流技術(shù)體系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用曼氏無針烏賊幼體采自浙江海洋大學(xué)東極苗種繁育基地的自培育烏賊苗種，胴長為2.63～2.88 cm，體重為3.47～4.69 g，隨機(jī)挑選健康苗種440尾，用于后續(xù)的標(biāo)志試驗(yàn)。標(biāo)志用動物體內(nèi)色素標(biāo)簽（HT202型）、玻璃管動物標(biāo)簽（HT157型，1.5 mm×7 mm）及配套檢測設(shè)備購于廣州洪騰條碼技術(shù)公司;茜素絡(luò)合物（Alizarin complexone，ALC）購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)志前處理。

為避免標(biāo)志過程中烏賊幼體發(fā)生大批量應(yīng)激噴墨死亡，標(biāo)記前參照Wearmouth等[15]的方法用MgCl2將烏賊幼體進(jìn)行麻醉，具體方法如下：將烏賊幼體轉(zhuǎn)移至50 L含1.9%的MgCl2·6H2O海水溶液中，3～5 min后烏賊即麻醉失去平衡，待烏賊完全喪失對外界刺激反應(yīng)時即可進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)志操作。

1.2.2 烏賊標(biāo)志操作。

采用背部注射法進(jìn)行茜素絡(luò)合物和動物體內(nèi)色素標(biāo)簽2種熒光化學(xué)物的標(biāo)志，具體操作過程如下：將注射器和標(biāo)志化合物滅菌消毒后，采用注射針頭以15°～45°角從烏賊背部刺入內(nèi)殼包膜下，推動注射器將0.1 mL 600 mg/L的茜素絡(luò)合物和稀釋7倍的動物體內(nèi)色素標(biāo)簽原液緩緩注入。同樣，采用背部內(nèi)殼埋植法進(jìn)行玻璃管動物標(biāo)簽的標(biāo)志，具體操作方法如下：將標(biāo)簽裝入配套的注射器針頭內(nèi)，將針頭從烏賊背部刺入內(nèi)殼包膜下，推動注射器將玻璃管動物標(biāo)簽植入，緩慢拔出針頭。標(biāo)志過程最好在烏賊麻醉后3～5 min內(nèi)迅速完成，以免麻醉時間過長造成烏賊難以復(fù)蘇，每個試驗(yàn)組標(biāo)志烏賊幼體110尾。試驗(yàn)同時設(shè)置對照組，將另外110尾烏賊麻醉，并用無標(biāo)志物的空載注射針頭扎入內(nèi)殼膜下，但無標(biāo)志物注入，其他操作過程同試驗(yàn)組。

1.2.3 標(biāo)志后養(yǎng)殖。

將試驗(yàn)組和對照組烏賊幼體直接投入盛有清潔海水的室內(nèi)養(yǎng)殖池中，加大養(yǎng)殖水體的充氧量，數(shù)分鐘后烏賊幼體即能逐步復(fù)蘇。將成功復(fù)蘇的97尾對照組樣本、98尾茜素絡(luò)合物標(biāo)記組樣本、101尾動物體內(nèi)色素標(biāo)簽標(biāo)記組樣本和104尾玻璃管動物標(biāo)簽標(biāo)記組樣本在同等條件下進(jìn)行室內(nèi)水泥池養(yǎng)殖，養(yǎng)殖水溫26～28 ℃，鹽度25‰～32‰，以鮮活野雜魚或雜蝦為餌料進(jìn)行投喂養(yǎng)殖，日投喂量為烏賊體重的20%，每日投喂2次為宜，正常進(jìn)行吸污和日常管理。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

養(yǎng)殖過程中每天記錄各試驗(yàn)組和對照組烏賊的死亡情況，統(tǒng)計(jì)累積死亡率，檢查各試驗(yàn)組烏賊標(biāo)志的保持情況。同時，在標(biāo)志后0、10、30、50 d（成體）時分別測量試驗(yàn)組和對照組烏賊的全長、胴長、胴寬、體重等生長性狀參數(shù)，分析烏賊的生長情況，使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件比較試驗(yàn)組和對照組在死亡率和生長指標(biāo)上的差異，并采用t檢驗(yàn)（Students t test，生長指標(biāo)）和卡方檢驗(yàn)（死亡率）進(jìn)行差異顯著性分析，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)志效果與保持率

將茜素絡(luò)合物和動物體內(nèi)色素標(biāo)簽注入曼氏無針烏賊內(nèi)殼包膜下，注射部位旋即形成一肉眼可見的橢圓形紫色（茜素）或藍(lán)色（體內(nèi)色素）斑塊，斑塊大小和形狀恰與烏賊內(nèi)殼大小和輪廓相一致。注入初期，由于烏賊幼體皮膚薄而透明，斑塊尤為明顯（圖1A、B），隨著烏賊個體的生長，盡管斑塊大小和形狀基本維持不變，但逐漸被日益增厚的背部皮膚、肌肉組織掩蓋而顏色變淺（圖1A、B），標(biāo)志后40～50 d烏賊背部斑塊仍依稀可見。剖開背部皮膚和肌肉組織，取出烏賊內(nèi)殼，可見茜素絡(luò)合物和動物體內(nèi)色素已將烏賊內(nèi)殼染成鮮明的紫色或藍(lán)色（圖1D、E），內(nèi)殼著色范圍大致為標(biāo)志初期烏賊內(nèi)殼大小，但標(biāo)志后新形成的內(nèi)殼部分未見著色，標(biāo)志后40～50 d時著色部位僅局限于內(nèi)殼基部位置，但仍十分明顯。將玻璃管動物標(biāo)簽注入烏賊內(nèi)殼

包膜下后，烏賊背部在標(biāo)簽注射部位旋即形成一突出隆起（圖1C），隆起大小與玻璃管動物標(biāo)簽大小一致，該隆起在標(biāo)志后40～50 d時仍清晰可見，采用配套的掃描閱讀器可在7～12 cm范圍內(nèi)準(zhǔn)確讀取玻璃管動物標(biāo)簽的編碼。剖開背部皮膚和肌肉組織，取出烏賊內(nèi)殼，可見玻璃管動物標(biāo)簽已被新形成的內(nèi)殼組織所包裹，逐步嵌入內(nèi)殼，成為內(nèi)殼中的一部分（圖1F）。由于試驗(yàn)中所用標(biāo)志物規(guī)格和注射劑量較小，未見標(biāo)志對烏賊幼體活動及行為產(chǎn)生明顯影響，試驗(yàn)組烏賊能正?；顒?、攝食和生長。試驗(yàn)結(jié)束時也未見各試驗(yàn)組烏賊背部標(biāo)志出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，各組標(biāo)簽的保持率接近100%。

2.2 不同標(biāo)志方法對曼氏無針烏賊生長的影響 對各試驗(yàn)組和對照組曼氏無針烏賊的生長情況進(jìn)行跟蹤檢測，共測定了標(biāo)志后0、10、30、50 d時的烏賊全長、胴長、胴寬、體重4個生長性狀，并計(jì)算了瞬時生長率。結(jié)果表明，標(biāo)志后曼氏無針烏賊生長迅速，50 d瞬時生長率為5.93%/d～6.07%/d。對各試驗(yàn)組和對照組曼氏無針烏賊的生長參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明在4個生長性狀參數(shù)上，除10 d時的體重外，各試驗(yàn)組和對照組烏賊在其他生長性狀參數(shù)上均無顯著差異（P>0.05）（表1），各試驗(yàn)組和對照組曼氏無針烏賊在標(biāo)志50 d后均達(dá)到成體規(guī)格且性成熟。

2.3 不同標(biāo)志方法對曼氏無針烏賊死亡率的影響 對各試驗(yàn)組和對照組曼氏無針烏賊存活情況進(jìn)行跟蹤檢測，結(jié)果表明不同標(biāo)志方法對標(biāo)志后烏賊的死亡率均未產(chǎn)生明顯影響。從表2可以看出，50 d動物體內(nèi)色素標(biāo)簽組、茜素絡(luò)合物標(biāo)志組和玻璃管動物標(biāo)簽組的死亡率分別為22.77%、18.37%、21.15%，而對照組死亡率為17.53%，各試驗(yàn)組與對照組相比沒有顯著差異（P≥0.05）;從階段性死亡率來看，標(biāo)志后短期損傷可能較大的10 d時死亡率也與30、50 d死亡率相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)均表明標(biāo)志未對烏賊的存活產(chǎn)生短期或長期的不良影響，各試驗(yàn)組曼氏無針烏賊的死亡可能多為養(yǎng)殖過程中的自然死亡。

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