楊彥霞，莊方方，閆福林

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省職工醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450001；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

巖白菜素是一類二氫異香豆素類化合物，是傳統(tǒng)中藥巖白菜(Bergenialigulata)[1]的主要活性成分，也存在于其他植物中，如鬼燈檠(RodgersiaaesculifoliaBatal.)[2]。作者在對天然植物鬼燈檠進(jìn)行化學(xué)成分研究中得到了大量的巖白菜素。巖白菜素有多種藥理活性，如降血脂[3]、抗人類免疫缺陷病毒[4]、抗炎[5]、抗心律失常[6]、神經(jīng)保護(hù)[7]、肝臟保護(hù)[8]和胃腸道保護(hù)[9]等。而對巖白菜素的抗腫瘤活性研究較少。1，2，3-三氮唑及其衍生物由于具有廣法的生物活性而一直備受關(guān)注[10]，有研究報道其具有抗腫瘤藥理活性[11]?；谌虻目鼓[瘤藥理活性，本研究擬以巖白菜素為初始原料，首先在分子結(jié)構(gòu)中引入炔烴，然后通過Click反應(yīng)[12]引入1，2，3-三氮唑基團(tuán)，制備含活性基團(tuán)三氮唑的巖白菜素衍生物，并采用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測制備的衍生物對胃癌MGC-803細(xì)胞、食管癌EC9706細(xì)胞、黑色素瘤B16細(xì)胞的體外抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器人食管癌EC9706細(xì)胞、胃癌MGC-803細(xì)胞及黑色素瘤B16細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；溴化芐、4-乙基氯化芐購自美國Sigma Aldrich公司，4-叔丁基氯芐購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，氟尿嘧啶(fluorouracil，F(xiàn)U)購自山東普德有限公司，柱層析用石油醚、乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)購自天津科密歐試劑公司，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司，MTT試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；柱層析用硅膠(200～300目)、薄層層析用硅膠GF254購自青島海洋化工廠，Bruker-400型核磁共振波譜儀購自德國Bruker公司，F(xiàn)TS-40紅外光譜儀購自美國Bio-Rad公司，X-4顯微熔點儀(溫度計未校正)購自上海精密儀器有限公司，Q-TOF 6540高分辨質(zhì)譜儀購自美國安捷倫公司。

1.2 巖白菜素衍生物的制備步驟1：取巖白菜素(32.8 mg，0.1 mmol)、3-溴丙炔 (35.7 mg，0.3 mmol)、KI (49.8 mg，0.2 mmol)、K2CO3(27.6 mg，0.2 mmol) 溶解于N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone，NMP)中，60 ℃反應(yīng) 4 h。薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)檢測，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，有機(jī)相用EA萃取3次，萃取液用過量的Na2SO4粉末干燥15 min，過濾、減壓濃縮得粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離純化，在石油醚(petroleum ether，PE)和EA不同比例(PE：EA，1：1、0：1)下洗脫，得到純凈產(chǎn)物1(圖1)。

步驟2：取1 mmol溴化芐與2 mmol疊氮化鈉于5 mL干燥圓底燒瓶中，加入2 mL二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)，30 ℃下反應(yīng)10 h，TLC檢測反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中緩慢加入 10 mL 乙醚和10 mL蒸餾水溫和條件下進(jìn)行萃取，有機(jī)相用過量的無水Na2SO4干燥15 min，過濾，濃縮得到芐基取代的疊氮化合物(圖1)。

步驟3：取中間產(chǎn)物1 (40.2 mg，0.1 mmol)、芐基取代的疊氮化合物(0.25 mmol)、CuSO4·5CuSO4·5H2O(5 mg)、和維生素C鈉(5 mg)于3 mL THF-H2O(v/v=1/1) 或者3 mLt-BuOH-H2O(v/v=1/1)反應(yīng)溶劑中，40 ℃條件下反應(yīng)4 h，TLC檢測反應(yīng)。結(jié)束后反應(yīng)溶液冷卻至室溫，有機(jī)相用EA萃取3次，萃取液用過量的Na2SO4粉末干燥15 min，過濾、減壓濃縮得粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離純化，在PE和EA不同比例(PE：EA，5：1、3：1)下洗脫，得到目標(biāo)產(chǎn)物2(圖1)。

化合物3～8的制備方法(圖1)同化合物2，區(qū)別于中間產(chǎn)物1與不同的疊氮化合物進(jìn)行Click反應(yīng)。

a：3-溴丙炔，KI，K2CO3，NMP，60 ℃，66.7%；b：NaN3，DMF，30 ℃；c：CuSO4·5H2O，維生素C鈉，THF-H2O或者 t-BuOH-H2O，40 ℃，產(chǎn)率74.4%～96.3%。

1.3 巖白菜素及其衍生物的抗腫瘤活性檢測

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞，食管癌EC9706細(xì)胞及黑色素瘤B16細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，正常傳代3次后將細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.01 U·L-1鏈霉素與0.10 U·L-1青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)，每2 ～ 3 d換液1次。

1.3.2 MTT法測定巖白菜素及合成的8種化合物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)分別取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的胃癌MGC-803細(xì)胞、食管癌EC9706細(xì)胞及黑色素瘤B16細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整為1×102L-1，接種在96孔板，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為給藥組、對照組和空白組。給藥組按照預(yù)定的濃度梯度分別加入巖白菜素及合成的8種衍生物待測樣品，每個梯度做6個重復(fù)。對照組細(xì)胞給予等體積的用于溶解樣品用的溶劑，空白組細(xì)胞給予三蒸水，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中溫育4 h，棄上清液，每孔加入200 μL DMSO，震蕩10 min，沉淀溶解，用酶標(biāo)儀在492 nm波長處檢測吸光度值，計算樣品對細(xì)胞的抑制率；采用氟尿嘧啶為陽性對照。抑制率=[(對照組吸光度值-空白組吸光度值)-(給藥組吸光度值-空白組吸光度值)]/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%，以抑制率為橫坐標(biāo)，藥物濃度為縱坐標(biāo)作圖，計算每個樣品的IC50，IC50≤100 μmol·L-1為有腫瘤細(xì)胞抑制作用，IC50>100 μmol·L-1為無腫瘤細(xì)胞抑制作用。本實驗連續(xù)測定3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 衍生物1～8的結(jié)構(gòu)特征化合物1：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-8，10-bis(prop-2-yn-1-yloxy)-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：66.7%，白色固體，m.p.180～182 ℃，IR (cm-1) 3 399，3 284，2 123，1 698，1 328，1 121，1 030；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 7.50 (s，1H)，5.61 (d，J=5.8 Hz，1H)，5.32 (d，J=5.2 Hz，1H)，4.95 (s，2H)，4.86 (d，J=10.4 Hz，1H)，4.71 (q，J=15.7 Hz，2H)，4.52 (s，1H)，3.93 (t，1H)，3.87 (s，3H)，3.66 (s，2H)，3.54 (s，2H)13C NMR (100 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 163.5，150.7，148.9，148.5，127.4，118.9，111.6，81.5，80.2，79.9，79.1，78.7，77.9，74.1，71.2，70.2，60.9，60.9，60.9，56.6。C20HO9(M+Na)+高分辨質(zhì)譜 (high-resdution mass spectrometer，HRESIMS)計算值427.099 9，實測值427.099 9。

化合物2：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-benzyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydro-pyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率 86.9%，白色粉末，m.p.105～106 ℃，IR (cm-1) 3 400，3 289，2 925，1 717，1 327，1 103，1 030；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 8.31 (s，1H)，8.28 (s，1H)，7.57 (s，1H)，7.41-7.26 (m，10H)，5.64 (s，2H)，5.62 (s，2H)，5.35 (d，J=5.5 Hz，1H)，5.26 (s，2H)，5.08 (q，J=11.3 Hz，2H)，4.89 (t，J=5.8 Hz，1H)，4.77 (d，J=10.3 Hz，1H)，4.03 (q，J=7.1 Hz，1H)，3.92 (t，J=9.9 Hz，1H)，3.73 (s，3H)，3.38 (s，2H)。13C NMR (100 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 163.6，151.6，149.3，148.5，143.6，142.6，136.2，136.1，128.9，128.8，128.3，128.2，128.0，127.9，125.1，124.9，119.1，111.6，82.0，80.4，74.1，71.4，70.2，66.2，62.3，60.9，60.7，59.9，52.9。C34HN6O9(M+Na)+HRESIMS計算值693.227 9，實測值 693.227 3。

化合物3：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-(4-ethylbenzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：91.3%，無色油狀物，IR (cm-1) 3 380，1 717，1 321，1 103，1 023；1H NMR (400 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 8.03 (s，1H)，7.97 (s，1H)，7.53 (s，1H)，7.20-7.15 (m，8H)，5.61 (d，J=11.3 Hz，1H)，5.53 (s，2H)，5.50 (s，2H)，5.19 (s，2H)，5.06 (d，J=11.4 Hz，1H)，4.53 (d，J=10.2 Hz，1H)，3.91-3.82 (m，2H)，3.77 (s，3H)，3.41 (t，J=6.7 Hz，2H)，3.35 (s，2H)，2.60 (q，J=7.6 Hz，4H)，1.18 (t，J=7.6 Hz，6H)。13C NMR (100 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 165.7，153.5，151.1，150.5，146.4，146.4，145.3，144.7，134.3，134.2，130.5，129.8，129.9，129.5，129.4，126.2，125.9，120.6，114.2，83.3，82.0，76.1，73.5，71.6，67.2，63.8，62.6，61.9，55.0，55.0，29.7，29.7，16.3，16.3。C38HN6O9(M+Na) HRESIMS計算值749.290 5，實測值 749.290 6。

化合物4：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-(4-(tert-butyl)benzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：80.8%，黃色粉末，m.p.121～123 ℃，IR (cm-1) 3 380，2 961，1 722，1 321，1 103，1 023；1H NMR (400 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 8.18 (s，2H)，7.60 (s，1H)，7.40 (dd，J=8.5，3.4 Hz，4H)，7.28 (dd，J=13.5，8.5 Hz，4H)，5.60 (s，4H)，5.28 (s，2H)，5.17 (d，J=10.8 Hz，1H)，5.07 (d，J=10.8 Hz，1H)，4.70 (d，J=10.3 Hz，1H)，3.97-3.91 (m，2H)，3.81 (s，3H)，3.76 (dd，J=12.5，5.0 Hz，1H)，3.48 (d，J=7.9 Hz，1H)，3.41 (s，2H)，1.27 (s，18H)。13C NMR (100 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 163.8，152.3，151.4，149.5，149.4，143.9，143.3，133.2，133.1，128.1，128.0，127.9，125.9，125.9，125.0，124.5，119.6，112.4，82.5，80.8，74.8，72.2，70.6，66.3，62.8，61.4，60.8，53.4，53.3，34.4，30.9。C42HN6O9(M+Na)+HRESIMS計算值805.353 1，實測值805.352 3。

化合物5：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-(4-fluorobenzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：96.3%，白色粉末，m.p.117～119 ℃，IR (cm-1) 3 380，2 961，1 722，1 321，1 127，1 023；1H NMR (400 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 8.23 (s，1H)，8.22 (s，1H)，7.58 (s，1H)，7.48-7.38 (m，4H)，7.14 (ddd，J=8.8，6.0，3.4 Hz，4H)，5.66 (s，2H)，5.65 (s，2H)，5.29 (s，2H)，5.20-5.03 (m，2H)，4.70 (d，J=10.3 Hz，1H)，4.04 (q，J=7.1 Hz，1H)，3.96 (t，J=7.6 Hz，1H)，3.94-3.90 (m，1H)，3.82 (s，3H)，3.75 (dd，J=12.5，5.0 Hz，1H)，3.42 (s，2H)。13C NMR (100 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 163.9，163.7，161.5，152.2，149.5，149.3，143.9，143.3，132.3，130.6，130.6，130.5，130.5，127.9，124.9，124.5，119.5，115.9，115.9，115.7，115.7，112.3，82.4，80.7，74.7，72.1，70.5，66.2，62.6，61.4，60.7，52.9，52.8。C34H32F2N6O9(M+Na)+HRESIMS計算值729.209 1，實測值729.206 4。

化合物6：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-8，10-bis((1-(4-nitrobenzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-2，3，4，4a-tetrahydropyrano [3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：74.4%，白色粉末，m.p.141～143 ℃，IR (cm-1) 3 368，1 717，1 522，1 346；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 8.37 (s，1H)，8.34 (s，1H)，8.25 (d，J=2.4 Hz，2H)，8.23 (d，J=2.4 Hz，2H)，7.57 (s，1H)，7.52 (t，J=9.1 Hz，4H)，5.83 (s，2H)，5.81 (s，2H)，5.59 (d，J=5.2 Hz，1H)，5.30 (s，3H)，5.09 (q，J=11.4 Hz，2H)，4.79 (d，J=2.8 Hz，1H)，3.92 (t，J=9.9 Hz，1H)，3.76 (s，2H)，3.65 (dd，J=13.9，8.8 Hz，1H)，3.60-3.53 (m，1H)，3.33 (s，2H)。13C NMR (100 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 163.5，151.6，149.3，148.5，147.4，147.3，143.7，143.5，143.4，142.8，129.1，129.0，127.3，125.4，125.3，124.0，119.1，111.6，82.0，80.3，74.1，71.3，70.2，66.2，62.3，60.9，60.8，52.0。C34H32N8O13(M+Na)+HRESIMS計算值783.198 1，實測值 783.196 8。

化合物7：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-8，10-bis((1-isopentyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：76.5%，無色油狀物，IR (cm-1) 3 369，2 956，1 722，1 321，1 103，1 030；1H NMR (400 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 8.14 (s，1H)，8.09 (s，1H)，7.59 (s，1H)，5.26 (s，2H)，5.18 (d，J=11.1 Hz，1H)，5.09 (d，J=11.2 Hz，1H)，4.69 (d，J=10.4 Hz，1H)，4.44 (dd，J=16.3，7.6 Hz，4H)，4.01-3.94 (m，1H)，3.87 (s，3H)，3.82-3.74 (m，2H)，3.46 (dd，J=15.5，7.5 Hz，1H)，3.30 (s，2H)，1.84-1.73 (m，4H)，1.49 (ddd，J=18.2，13.4，6.7 Hz，2H)，0.95 (t，J=6.3 Hz，12H)。13C NMR (100 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 165.8，153.6，151.0，150.7，145.0，144.3，129.2，126.1，125.9，120.6，113.8，83.5，82.1，76.2，73.6，71.7，67.5，63.8，62.6，62.0，50.1，50.0，40.4，40.3，26.9，26.7，22.8，22.7。C30H42N6O9(M+Na)+HRESIMS計算值653.290 5，實測值 653.289 9。

化合物8：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-hexyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydr-opyrano[3，2-c] isochromen-6(10bH)-one，產(chǎn)率：87.8%，白色粉末，m.p.103～105 ℃，IR (cm-1) 3 314，2 931，1 722，1 328，1 103，1 036；1H NMR (400 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 8.12 (s，1H)，8.09 (s，1H)，7.62 (s，1H)，5.28 (s，2H)，5.19 (d，J=11.1 Hz，1H)，5.12 (d，J=11.2 Hz，1H)，4.73 (d，J=10.4 Hz，1H)，4.42 (q，J=7.3 Hz，4H)，4.03-3.92 (m，2H)，3.88 (s，3H)，3.83-3.79 (m，1H)，3.48 (d，J=7.9 Hz，1H)，3.32 (s，2H)，1.96-1.84 (m，4H)，1.30 (dd，J=13.1，10.9 Hz，12H)，0.89 (dd，J=8.7，4.3 Hz，6H)。13C NMR (100 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 165.8，153.6，151.0，150.8，145.0，144.3，129.2，126.1，125.9，120.7，113.9，83.5，82.1，76.2，73.6，71.7，67.5，63.8，62.6，62.0，51.7，51.6，32.5，31.5，31.5，27.4，23.8，14.6。C32H46N6O9(M+Na)+HRESIMS計算值681.321 8，實測值681.319 5。

2.2 巖白菜素及其衍生物的體外抗腫瘤活性結(jié)果見表1。巖白菜素?zé)o抗腫瘤活性，其1，2，3-三氮唑衍生物中苯環(huán)、脂肪環(huán)的引入均能提高巖白菜素的抗腫瘤活性。尤其是苯環(huán)對位被吸電子基及空間位阻比較大的叔丁基取代的衍生物4對食管癌EC9706細(xì)胞抑制活性較好。

表1 巖白菜素及其衍生物的體外抗腫瘤活性

3 討論

為了提高巖白菜素的抗腫瘤活性，本實驗建立了在巖白菜素分子結(jié)構(gòu)中引入活性基團(tuán)三氮唑的合成方法，并對合成的衍生物進(jìn)行抗腫瘤活性的評價。

本研究結(jié)果顯示，中間產(chǎn)物炔烴化合物1對食管癌EC9706細(xì)胞顯示出明顯的抑制活性，巖白菜素的1，2，3-三氮唑衍生物的抗腫瘤活性明顯強于巖白菜素。其中，1，2，3-三氮唑衍生物上取代基R在抗腫瘤活性方面起重要的作用，并且?guī)r白菜素衍生物結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上取代基的電子屬性及空間位阻也不同程度的影響其抗腫瘤活性，如苯環(huán)對位上含有給電子基團(tuán)如4-CH2CH3和4-C(CH3)3(化合物3和4)或者含有吸電子基團(tuán)如4-F和4-NO2(化合物5和6)的衍生物的抗腫瘤活性明顯優(yōu)于苯環(huán)對位上無取代基的衍生物(化合物2)，尤其是苯環(huán)對位上含4-C(CH3)3空間位阻比較大的衍生物(化合物4)，對胃癌MGC-803細(xì)胞、食管癌EC9706細(xì)胞和黑色素瘤B16細(xì)胞的抑制活性明顯強于巖白菜素，IC50分別低至12.0、6.2、17.6 μmol·L-1，對食管癌EC9706細(xì)胞的抑制活性優(yōu)于陽性對照藥品氟尿嘧啶(IC50為6.3 μmol·L-1)。用脂肪鏈取代苯環(huán)的衍生物(化合物7，8)，其抗腫瘤活性明顯強于巖白菜素，但與苯環(huán)取代衍生物相比，其抗腫瘤活性無明顯增強。