劉奐弟，李 莎，代雪霞，李冬晨，何思賢，郭帥鋒，王藏雪，牛玉娜

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省免疫與靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

血小板數(shù)量及形態(tài)是血常規(guī)檢測(cè)的重要內(nèi)容，不僅可以幫助醫(yī)生診斷血小板相關(guān)性疾病，還可以評(píng)估患者的治療效果[1]。血小板對(duì)溫度和保存時(shí)間較為敏感[2]，不當(dāng)?shù)谋４鏈囟群蜁r(shí)間會(huì)影響血小板的形態(tài)及功能。在臨床工作中，為了避免血小板激活，不能及時(shí)檢測(cè)的全血標(biāo)本均為室溫保存。然而，溫度越高，細(xì)胞的代謝會(huì)越旺盛[3]，在營養(yǎng)得不到及時(shí)供給的情況下，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生改變。因此，室溫保存全血有可能不利于血小板形態(tài)和功能的維持。本研究將全血分別于室溫和4 ℃條件下保存，觀察血小板形態(tài)和功能的變化，旨在為臨床合理選擇全血樣本的保存溫度提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇30例健康志愿者為研究對(duì)象，男10例，女20例，年齡18～22(20±2)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)出生至現(xiàn)在均居住于河南?。?2)無菌血癥；(3)無高脂血癥；(4)無糖尿?。?5)無感染；(6)無呼吸系統(tǒng)疾??；(7)無免疫系統(tǒng)疾??；(8)無血液系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試對(duì)象均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人CD61抗體(FITC anti-human CD61 抗體)購自美國Biolegend公司，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人CD62P抗體(PE anti-human CD62P抗體)購自美國Invitrogen公司，Sysmex KX-21血細(xì)胞分析儀配套稀釋液、溶血?jiǎng)┖颓逑匆嘿徸匀毡緎ysmex 公司，鈣熒光探針Fluo-3AM購自北京索萊寶科技有限公司，瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，無鈣鎂酚紅的磷酸鹽緩沖液(Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS)購自美國Hyclone公司,二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)購自德國Merck公司；含乙二胺四乙酸二鉀 (ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium，EDTA-K2)抗凝劑的一次性真空采血管購自上?？到♂t(yī)療器械有限公司，Sysmex KX-21血細(xì)胞分析儀購自日本Sysmex 公司，全波長掃描式多功能讀數(shù)儀購自美國Thermo Scientific公司，Guava easyCyte HT流式細(xì)胞儀購自美國Millipore公司，BX51/52顯微鏡購自日本Olypus公司。

1.3 血小板形態(tài)觀察及血小板數(shù)量、體積檢測(cè)采集志愿者清晨空腹肘靜脈血 2 mL，置于含EDTA-K2抗凝劑的真空管中，立即8字顛倒混勻，充分抗凝，作為對(duì)照組微量吸管虹吸取血7～8 μL，將血液滴于載玻片一端，并制備頭體尾分明的舌形血涂片，血涂片完全干燥后，使用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液染色，BX51/52顯微鏡下觀察血涂片的質(zhì)量及染色情況，在血涂片的體尾交界處觀察血小板的形態(tài)、結(jié)構(gòu)；同時(shí)，將其余血液標(biāo)本置于SYSMEX-21血細(xì)胞分析儀，全血模式下檢測(cè)血小板數(shù)量、大血小板比例(platelet large cell ratio，P-LCR)、平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)和血小板分布寬度(the platelet volume distribution width，PDW)；然后將血液標(biāo)本分為2份，其中1份4 ℃保存(4 ℃組)，另1份室溫保存(室溫組)，分別于保存4、8、24 h后按上述方法制作血涂片，觀察4 ℃組和室溫組血液標(biāo)本中血小板的形態(tài)、結(jié)構(gòu)；并使用SYSMEX-21血細(xì)胞分析儀檢測(cè)4 ℃組和室溫組血液標(biāo)本的血小板數(shù)量、P-LCR、MPV和PDW。

1.4 血小板活化表面標(biāo)志物CD62P檢測(cè)采集志愿者清晨空腹肘靜脈血10 mL，置于含有EDTA-K2抗凝劑的真空管，8字顛倒混勻，分為對(duì)照組、4 ℃ 4 h組、4 ℃ 24 h組和室溫 4 h組、室溫24 h組，每組2 mL。將對(duì)照組血液標(biāo)本即刻進(jìn)行梯度離心，將室溫 4 h組、室溫24 h組和4 ℃ 4 h組、4 ℃ 24 h組血液標(biāo)本分別于保存相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行梯度離心，獲得血小板[4]，DPBS洗滌3遍，40 g·L-1多聚甲醛室溫固定30 min，DPBS洗滌3遍，100 μL DPBS重新懸浮血小板，分別加入FITC anti-human CD61 抗體和PE anti-human CD62P抗體，室溫孵育30 min，DPBS洗滌3遍，300 μL DPBS重新懸浮血小板，100目細(xì)胞過濾器過濾，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，Guava easyCyte HT流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察血小板的絕對(duì)計(jì)數(shù)和熒光強(qiáng)度(arbitary unit，AU)，計(jì)算血小板的平均熒光強(qiáng)度[12-18]。

1.5 血小板內(nèi)Ca2+水平檢測(cè)采集志愿者清晨空腹肘靜脈血10 mL，置于含有EDTA-K2抗凝劑的真空管，8字顛倒混勻，分為對(duì)照組、4 ℃ 4 h組、4 ℃ 24 h 組和室溫 4 h組、室溫24 h組，每組 2 mL。將對(duì)照組血液標(biāo)本即刻進(jìn)行梯度離心，將室溫 4 h組、室溫24 h組組和4 ℃ 4 h組、4 ℃ 24 h血液標(biāo)本分別于保存相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行梯度離心，獲得血小板[4]，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將血小板濃度調(diào)整為10×109L-1。用含有5 μmol·L-1Fluo-3 AM的DMSO溶液和細(xì)胞一起在室溫下孵育30 min進(jìn)行熒光探針裝載，DPBS洗滌3遍，100 μL DPBS重新懸浮血小板，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，在激發(fā)波長為488 nm的條件下使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀檢測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度[5]。

2 結(jié)果

2.1 各組血液標(biāo)本血小板形態(tài)變化結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比較，隨著血液標(biāo)本保存時(shí)間延長，4 ℃組血小板體積稍增大，24 h時(shí)大血小板比例明顯增多(圖1A、圖1B、圖1C、圖1D)，室溫組血小板體積明顯增大，并出現(xiàn)空泡現(xiàn)象(圖1E、圖1F、圖1G)。全血保存4 h時(shí)，室溫組大血小板明顯增多，血小板結(jié)構(gòu)較疏松(圖1B、圖1E)；全血保存8 h時(shí)，室溫組大血小板明顯增多，血小板結(jié)構(gòu)較疏松并出現(xiàn)空泡現(xiàn)象(圖1C、圖1F)；全血保存24 h時(shí)，室溫組畸形血小板明顯增多，血小板結(jié)構(gòu)較疏松，空泡現(xiàn)象更加明顯(圖1D、圖1G)。

A：對(duì)照組；B：4 ℃組保存4 h；C：4 ℃組保存8 h；D：4 ℃組保存24 h；E：室溫組保存4 h；F：室溫組保存8 h；G：室溫組保存24 h。

2.2 各組血液標(biāo)本血小板數(shù)量、P-LCR、MPV和PDW比較結(jié)果見表1。對(duì)照組及室溫和4 ℃組保存4、8、24 h組各組之間的血小板數(shù)量兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，室溫組和4 ℃組血液標(biāo)本保存4、8、24 h的P-LCR、MPV、PDW均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。室溫組血標(biāo)本保存4、8、24 h的P-LCR、MPV和PDW兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4 ℃ 組血標(biāo)本保存8、24 h的P-LCR和MPV與4 h時(shí)比較顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4 ℃ 組血液標(biāo)本保存24 h的P-LCR和MPV與8 h時(shí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4 ℃組血標(biāo)本保存4、8 h的PDW比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，保存24 h的PDW與4、8 h時(shí)比較顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4 ℃組保存4、8 h 的P-LCR、MPV和PDW與室溫組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4 ℃組與室溫組保存24 h的P-LCR、MPV和PDW比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組血液標(biāo)本血小板數(shù)量、P-LCR、MPV及PDW比較

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與室溫組比較bP<0.05；與4 h比較cP<0.05；與8 h比較dP<0.05。

2.3 各組血液標(biāo)本血小板表面活化標(biāo)志物CD62P表達(dá)水平比較對(duì)照組、室溫組保存4、24 h時(shí)及 4 ℃ 組保存4、24 h時(shí)血小板表面CD62P表達(dá)水平分別為(65.57±2.86)、(84.36±2.69)、(85.79±3.11)、(77.18±3.22)、(83.8±2.12)AU。與對(duì)照組比較，室溫組保存4、24 h及4 ℃組保存4、24 h的血小板表面CD62P表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與室溫組同時(shí)間點(diǎn)比較，4 ℃ 組保存4、24 h的血小板表面CD62P表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。室溫組保存24 h的血小板表面CD62P表達(dá)水平與4 h時(shí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4 ℃組保存24 h的血小板表面CD62P表達(dá)水平與4 h時(shí)比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組血小板內(nèi)Ca2+水平比較對(duì)照組、室溫組保存4、24 h時(shí)及4 ℃組保存4、24 h時(shí)血小板內(nèi)Ca2+水平分別為(539.25±130.39)、(714.00±81.70)、(963.25±58.25)、(535.75±98.87)、(605.00±220.40)AU。與對(duì)照組比較，室溫組保存4、24 h血小板內(nèi)Ca2+水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組及4 ℃組保存4、24 h的血小板內(nèi)Ca2+水平兩兩比較均無顯著差異(P>0.05)。與室溫組同時(shí)間點(diǎn)比較，4 ℃組保存4、24 h的血小板內(nèi)Ca2+水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。室溫組保存24 h的血小板內(nèi)Ca2+水平與4 h比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

血小板是巨核細(xì)胞脫落的細(xì)胞質(zhì)顆粒[6]，在機(jī)體凝血、腫瘤發(fā)生和免疫過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。準(zhǔn)確檢測(cè)血小板的數(shù)量、體積、形態(tài)和功能不僅可以幫助醫(yī)生診斷和鑒別疾病，還可以促進(jìn)科學(xué)研究的發(fā)展。目前臨床上不能及時(shí)檢測(cè)的血液標(biāo)本均為室溫保存，有可能不利于血小板形態(tài)和功能的維持。因此，有研究探討4 ℃條件下保存血液對(duì)血小板形態(tài)和功能的影響，旨在為臨床合理選擇血液樣本保存方法提供參考。

龔慶輝等[10]研究顯示，室溫保存血液2 h，血小板的P-LCR、MPV和PDW已經(jīng)發(fā)生顯著變化；而 4 ℃ 保存24 h，可以觀察到血小板的P-LCR、MPV和PDW發(fā)生顯著變化。在該研究中，4 ℃保存組的樣本進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)前，需要提前取出并使其恢復(fù)至室溫，這個(gè)過程可能導(dǎo)致4 ℃保存組的血小板受到影響，發(fā)生顯著變化；并且4 ℃保存組與室溫保存組標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)不一致，4 ℃保存組未對(duì)保存2～8 h的血液進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致無法確定4 ℃保存組標(biāo)本P-LCR、MPV和PDW發(fā)生變化的時(shí)間點(diǎn)。李清澤等[11]研究發(fā)現(xiàn)，4 ℃保存血液3 h，血小板MPV即發(fā)生顯著變化；室溫保存血液4 h，血小板的MPV才發(fā)生顯著變化；在該研究中，盡管4 ℃保存組與室溫保存組檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)一致，但4 ℃條件下存放的標(biāo)本在測(cè)定前也均恢復(fù)至室溫。因此，4 ℃保存組的檢測(cè)結(jié)果同樣無法排除室溫的影響。

在本研究中，為了排除室溫對(duì)4 ℃保存組檢測(cè)結(jié)果的影響，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)前對(duì)4 ℃組標(biāo)本不進(jìn)行室溫復(fù)溫處理；同時(shí)，為了明確血小板功能是否受全血保存溫度影響，本研究根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5，12-18]的檢測(cè)方法對(duì)血小板活化和Ca2+釋放功能進(jìn)行了研究。本研究結(jié)果顯示：(1)對(duì)照組、室溫和4 ℃組保存4、8、24 h組各組之間的血小板數(shù)量兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同溫度和保存時(shí)間對(duì)血小板數(shù)量無顯著影響；(2)隨著保存時(shí)間的延長，4 ℃組和室溫組血小板體積均增大，且室溫組血小板體積增加更加明顯，并出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，血小板結(jié)構(gòu)較疏松；隨著保存時(shí)間的延長，與對(duì)照組比較，4 ℃組和室溫組P-LCR、MPV和PDW均顯著增大，血小板表面CD62P表達(dá)水平顯著升高。與對(duì)照組比較，室溫組4和24 h的血小板內(nèi)Ca2+水平均顯著升高，4 ℃組4和24 h的血小板內(nèi)Ca2+水平無顯著變化。同時(shí)，4 ℃組24 h時(shí)血小板表面CD62P表達(dá)水平與 4 h 時(shí)比較顯著升高，室溫組24 h時(shí)血小板內(nèi)Ca2+水平與 4 h 時(shí)比較顯著升高；提示在4 ℃和室溫保存狀態(tài)下，隨著保存時(shí)間的延長，會(huì)對(duì)血小板形態(tài)和功能造成一定的影響；(3)室溫組保存4、8、24 h的P-LCR、MPV和PDW兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4 ℃組保存4、8 h的P-LCR、MPV和PDW與室溫組比較顯著降低，4 ℃組與室溫組保存24 h的P-LCR、MPV和PDW比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而4 ℃組保存8、24 h的P-LCR、MPV與4 h時(shí)比較顯著增大，保存24 h的PDW與4、8 h時(shí)比較顯著增大；提示血小板對(duì)保存溫度比較敏感，室溫保存4 h以后即會(huì)對(duì)血小板P-LCR、MPV和PDW造成較大的影響，而在一定時(shí)間內(nèi)，4 ℃保存對(duì)血小板的影響低于較室溫保存。

綜上所述，全血標(biāo)本4 ℃保存并在4 h內(nèi)完成檢測(cè)，可以最大限度維持血小板原始狀態(tài)，提高血小板檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的準(zhǔn)確性。