楊 梅，范 圍，黃 瑤，袁容娣

(中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科，重慶 400037)

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，也是視網(wǎng)膜內(nèi)最重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在視網(wǎng)膜的病理、生理過程中扮演著重要角色[1]。數(shù)量上，它是視網(wǎng)膜內(nèi)數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞；結(jié)構(gòu)上，Müller細(xì)胞從光感受器開始至內(nèi)界膜結(jié)束，橫跨分布于整個視網(wǎng)膜，可維持視網(wǎng)膜的正常結(jié)構(gòu)；功能上，其同時具備星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的功能，可維持細(xì)胞微環(huán)境的平衡，還能分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對視網(wǎng)膜神經(jīng)元起到支持、滋養(yǎng)的作用。Müller細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)可為視網(wǎng)膜病變的細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育學(xué)和電生理學(xué)等研究提供一個重要平臺。因此，在體外建立穩(wěn)定的Müller細(xì)胞培養(yǎng)體系對于研究Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的生理、病理作用具有重要意義。Müller細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是細(xì)胞純化，細(xì)胞純化方法主要有機械吹打法、恒溫?fù)u床法、胰蛋白酶消化法等[2-4]，這些方法均利用了Müller細(xì)胞較視網(wǎng)膜組織中其他細(xì)胞貼壁緊的原理。機械吹打法吹打力度和次數(shù)不易掌控，影響細(xì)胞的活性；恒溫?fù)u床法需要在搖床震蕩4～6 h，在外界暴露時間過長，操作繁瑣，還有加重污染的風(fēng)險；而胰蛋白酶消化法雖較前2種方法簡單，但在試驗中發(fā)現(xiàn)，單純用胰蛋白酶消化存在細(xì)胞純度不高的問題，而過度消化又會損傷細(xì)胞。為了找到一種操作簡單、細(xì)胞純度更高的培養(yǎng)方法，作者結(jié)合本實驗室條件，改良出一種Sprague Dawley(SD)新生大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞培養(yǎng)方法，此方法操作簡單，獲得的細(xì)胞純度高，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物新生1～2 d的SD大鼠，雌雄不限，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供，本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器高糖達(dá)爾伯克改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM) 購自美國Hyclone公司，胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶購自美國Gibco公司，小鼠抗Vimentin單克隆抗體購自英國Abcom公司，熒光二抗(488)標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自英國Thermo公司，小鼠抗NeuN單克隆抗體購自美國Millpore公司；離心機、細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 Müller細(xì)胞原代培養(yǎng)將新生SD大鼠浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中2 min，斷頭處死，摘除眼球，將眼球直接浸泡在含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗(100 U·mL-1青霉素及100 g·L-1鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜。去除浸泡眼球的培養(yǎng)基，加入 2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中消化1 h，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM終止消化；將眼球移入另一個無菌培養(yǎng)皿中，在高倍顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，收集于無菌離心管中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，用70 μm的濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，按3×105L-1接種于培養(yǎng)瓶中，置于 37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱過夜；第2天觀察細(xì)胞貼壁情況，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 d，細(xì)胞密度達(dá)到80%予以傳代。

1.3.2 Müller細(xì)胞傳代與純化去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶液1 mL，輕晃培養(yǎng)瓶，1 min后吸除胰蛋白酶溶液，重復(fù)操作2次，以去除貼附能力較差的雜細(xì)胞，純化Müller細(xì)胞。再加入2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液2 mL，反復(fù)吹打瓶底，鏡下觀察見細(xì)胞絕大部分變圓、懸浮，立即加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 2 mL終止消化；將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，去上清液，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，調(diào)整細(xì)胞密度，按3×105L-1接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 d，細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行傳代。

1.3.3 視網(wǎng)膜神經(jīng)元純度鑒定收集第3代Müller細(xì)胞，以1.5×105L-1接種于放有載玻片的24孔板中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次3 min，40 g·L-1多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS洗3次，每次 3 min；體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100 室溫透膜 15 min，PBS洗3次，每次3 min；體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清封閉1 h，棄血清；加入一抗小鼠抗NeuN單克隆抗體(1：500)；另取一孔用PBS代替一抗做陰性對照，4 ℃ 孵育過夜。PBS洗3次，每次3 min，加入熒光二抗(488)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1：300)，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min，1：2 000的Hoechst33342染核2 min，PBS洗3次，每次3 min。取出孔底載玻片，防熒光淬滅封片劑封片。分別在載玻片上、下、左、右、正中5個方向隨機取5個視野拍照，計數(shù)NeuN熒光(綠色)染色陽性細(xì)胞數(shù)目，神經(jīng)元純度=NeuN 陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/Hoechst 33342核染陽性細(xì)胞總數(shù)×100%。。

1.3.4 Müller細(xì)胞純度鑒定取“1.3.3”項下體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清封閉1 h的細(xì)胞，棄血清，加入一抗小鼠抗Vimentin單克隆抗體(1：100)，PBS代替一抗做陰性對照，4 ℃孵育過夜。去一抗，PBS洗3次，每次3 min，加入熒光二抗(488)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1：300)，室溫避光孵育1 h，去二抗，PBS洗3次，每次3 min，1：2 000的Hoechst33342染核 2 min，PBS洗3次，每次3 min。取出孔底載玻片，防熒光淬滅封片劑封片。分別在載玻片上、下、左、右、正中5個方向隨機取5個視野拍照，計數(shù)Vimentin熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)目，Müller細(xì)胞純度=Vimentin陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/Hoechst 33342核染陽性細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 原代及傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長情況培養(yǎng)24 h后，部分細(xì)胞已貼壁生長，散在分布；培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞胞體狹長，密度約40%；培養(yǎng)6～8 d后，細(xì)胞已形成融合狀態(tài)，細(xì)胞體變大，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，密度約80%；傳至第4代的細(xì)胞形態(tài)不一，有突起，細(xì)胞體寬大，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，見圖1。

2.2 神經(jīng)元純度鑒定將傳至第4代的原代細(xì)胞行NeuN和Hoechst33342免疫熒光染色，各視野均無陽性表達(dá)細(xì)胞，提示無神經(jīng)元共生長。

2.3 Müller細(xì)胞純度鑒定傳至第4代的細(xì)胞行Vimentin和Hoechst33342免疫熒光雙染，鏡下可見大量Vimentin陽性細(xì)胞，Müller細(xì)胞純度>95%；見圖2。

圖1 傳代培養(yǎng)至第4代的Müller細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡，×100)

A：Hoechst33342免疫熒光核染；B：Vimentin免疫熒光細(xì)胞質(zhì)染色；C：A、B圖的融合。

3 討論

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜特有的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在視網(wǎng)膜中發(fā)揮著重要的病理、生理作用，體外培養(yǎng)Müller細(xì)胞是研究其病理、生理作用的重要手段[5-6]。然而，SD大鼠視網(wǎng)膜中細(xì)胞成分復(fù)雜，除了Müller細(xì)胞外，還含有星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞等，將其中的Müller細(xì)胞分離、純化培養(yǎng)是該細(xì)胞培養(yǎng)方法的核心步驟。目前，根據(jù)Müller細(xì)胞比重、貼壁時間、黏著力、細(xì)胞壽命等方面的特性，培養(yǎng)和純化Müller細(xì)胞的方法較多，但各有優(yōu)劣。酶消化法[7-8]和恒溫振蕩法[9]是最常用的Müller細(xì)胞純化方法，其原理均是利用Müller細(xì)胞較其他細(xì)胞容易貼壁的特點，對Müller細(xì)胞進(jìn)行較好的分離和純化，但也存在著早期神經(jīng)元共生長、分離視網(wǎng)膜操作較困難、暴露于外界時間長、易污染等不足之處。

本研究對體外培養(yǎng)Müller細(xì)胞的方法進(jìn)行了3個方面的改良。首先，取出眼球后將其浸泡于含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的無血清DMEM培養(yǎng)基中，在 37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜。在這個孵育過程中，眼球組織處于一種缺氧的狀態(tài)，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞因耐受缺氧能力差而受損，而Müller細(xì)胞的耐受缺氧能力較強，在孵育過程中更利于其分裂[10]。而后，將眼球消化1 h，再分離視網(wǎng)膜，這與其他文獻(xiàn)[11]報道的先分離視網(wǎng)膜，再對視網(wǎng)膜消化的方法也有所不同。本研究中，眼球被整個消化，更有利于分離視網(wǎng)膜。由于選取的動物較小，分離視網(wǎng)膜時較難操作，而眼球消化1 h后，體積有所增大，組織變軟、變松，在去除眼前節(jié)時眼球不易滾動，更易操作，而視網(wǎng)膜也更易剝脫。在細(xì)胞傳代時，由于Müller細(xì)胞的貼附性最強，用胰蛋白酶反復(fù)消化2次，留取最終仍然貼壁的細(xì)胞傳代，以達(dá)到純化Müller細(xì)胞的目的，較恒溫震蕩法節(jié)省時間，減少了細(xì)胞污染的機會，并且比其他酶消化法多使用一次胰蛋白酶消化，對Müller細(xì)胞的篩選更嚴(yán)格。

視網(wǎng)膜中存在3種膠質(zhì)細(xì)胞，即Müller細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。Vimentin是視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白[12]，因此，本研究采用Vimentin鑒定Müller細(xì)胞，Vimentin熒光染色陽性的細(xì)胞為Müller細(xì)胞。本研究熒光染色鑒定結(jié)果顯示，視野下無NeuN陽性核染細(xì)胞，說明無神經(jīng)元共生長情況，而Vimentin陽性表達(dá)細(xì)胞占比>95%，均為Müller細(xì)胞。

綜上所述。本研究改良的SD新生大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞培養(yǎng)方法操作簡單，純度高，是一種切實可行的實驗方法。