王國(guó)征，吳遠(yuǎn)彬，郭坤元，代喜平

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，廣東省中醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510120)

急性白血病是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤，白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell，LSC)是其復(fù)發(fā)和難治根源之一[1-2]。LSC在多個(gè)基因和信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)上發(fā)生異常，失去正常的增殖分化能力，具有很強(qiáng)的無(wú)控性自主增殖能力，能夠?qū)λ幬?、放射和免疫?xì)胞的殺傷產(chǎn)生強(qiáng)大的抵抗力[3]。研究表明，從急性髓系白血病細(xì)胞株KG1a中分選的CD34+CD38-KG1a具有LSC生物學(xué)特性，可抵抗化學(xué)藥物的殺傷作用[4]。本研究擬探討CD34+CD38-KG1a對(duì)自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的抵抗作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑和儀器人急性髓系白血病細(xì)胞株K562由本實(shí)驗(yàn)室凍存，KG1a細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存；PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津血液研究所，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)殺傷活性試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，抗主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)-I類鏈相關(guān)分子A/B(MHC class I chain-related molecules A and B，MICA/B)單抗、抗人巨細(xì)胞病毒UL16結(jié)合蛋白(human cytomegalovirus glycoprotein UL16 binding proteins，ULBP)1單抗、抗ULBP2單抗、抗ULBP3單抗、抗人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) -Ⅰ類分子抗體、CD38-異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、抗-FITC免疫磁珠、抗CD16CD56免疫磁珠購(gòu)自德國(guó)MiltenyiBiotec公司，殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(inhibitory killer cell immunoglobulin- like receptor，KIR)基因檢測(cè)試劑盒、HLA基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Biotest公司；精密加樣槍購(gòu)自美國(guó)Apendorff公司，免疫磁珠細(xì)胞分選儀(immune magnetic bead separator，MACS)、LD分離柱購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司，ELX800光吸收酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-TeK公司，Eppendorf高速低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Coulter公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，Olympus倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，一次性100 cm2培養(yǎng)瓶、試管、96孔培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司，血球計(jì)數(shù)板購(gòu)自上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)37 ℃水浴箱中溶解凍存的K562、KG1a細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重懸浮細(xì)胞于4 mL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于 37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。

1.3 免疫磁珠法分選CD34+CD38-KG1a細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KG1a細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，每107個(gè)細(xì)胞加100 μL PBS和帶FITC的CD38抗體10 μL，4 ℃下避光孵育30 min。PBS洗滌1次，棄上清液，重懸浮細(xì)胞，每107個(gè)細(xì)胞加PBS 9 μL和抗FITC的免疫磁珠10 μL，混勻后4 ℃下孵育15 min，PBS再洗滌1次，棄上清液，重懸于5 mL分選液中，將LD柱安裝在磁鐵中，取2 mL分選液濕潤(rùn)LD分離柱，細(xì)胞懸液加入LD柱中，每次加入1 mL緩沖液，沖洗2次，無(wú)菌試管收集分離的CD34+CD38-KG1a細(xì)胞。每106個(gè)細(xì)胞加1 μg單抗，4 ℃下孵育30 min，加PBS 2 mL，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，重新懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離細(xì)胞的純度。

1.4 同種異體NK細(xì)胞分離采用梯度密度沉淀法分離4例健康個(gè)體外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌后，每107個(gè)細(xì)胞加緩沖液80 μL和抗NK細(xì)胞免疫磁珠20 μL，4 ℃下孵育15 min，每107個(gè)細(xì)胞加緩沖液1 mL，離心，棄上清。每108個(gè)細(xì)胞加緩沖液500 μL重新懸浮細(xì)胞，置于Mini-MACS磁場(chǎng)中進(jìn)行分離，一次性試管收集CD3陰性細(xì)胞，再次用 500 μL 緩沖液沖洗分選的CD56陽(yáng)性細(xì)胞，共2次，卸下分選柱，加RPMI-1640培養(yǎng)液 1 mL，推注器推出陽(yáng)性細(xì)胞，分選的CD3-CD16+CD56+細(xì)胞即為NK細(xì)胞。PBS洗滌2次，每106個(gè)細(xì)胞加CD3FITC/CD16CD56PE單抗1 μg，4 ℃孵育 30 min，加入PBS 2 mL，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清后重懸細(xì)胞，以同型的IgG為對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞數(shù)。

1.5 NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的殺傷作用以NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞為靶細(xì)胞對(duì)照，分離的CD34+CD38-KG1a細(xì)胞為靶細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×108L-1，加入96孔板中，每孔 50 μL。將細(xì)胞分為效靶組、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組和空白對(duì)照組。效靶組按不同效靶比(5：1、10：1、20：1)分別加入不同濃度的NK細(xì)胞各50 μL；效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組加入NK細(xì)胞50 μL、RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL；靶細(xì)胞自發(fā)釋放組加入靶細(xì)胞50 μL、RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL；靶細(xì)胞最大釋放組加入裂解液10 μL、靶細(xì)胞50 μL、RPMI-1640培養(yǎng)基50 μL；空白對(duì)照組加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。各組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于37 ℃下在含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，2 000 r·min-1離心5 min，吸取 50 μL 上清，加入96孔平底酶標(biāo)板中，加LDH底物反應(yīng)液50 μL，室溫下避光放置30 min，每孔加 50 μL 終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nm 處吸光度值。計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性。殺傷率=(效靶組平均吸光度值-靶細(xì)胞自然釋放組平均吸光度值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組平均吸光度值)/(靶細(xì)胞最大釋放組平均吸光度值-靶細(xì)胞自然釋放組平均吸光度值)×100%。

1.6 NK細(xì)胞KIR和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞HLA-Ⅰ基因分型采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性引物法(polymerase chain reaction with sequence specific primers，PCR-SSP)進(jìn)行NK細(xì)胞KIR和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞HLA-Ⅰ基因分型，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

融化試劑盒配備PCR緩沖液，震蕩混勻，每管1份(150.0 μL)；取出Taq酶置于冰盒上；加60 μL蒸餾水和2.4 μL Taq酶于備用的PCR緩沖液管，震蕩混勻。取上述混合液8 μL加至污染監(jiān)控孔(對(duì)照孔)。加25 μL提純的DNA標(biāo)本至剩余的混合液中，震蕩均勻；除對(duì)照孔外，每孔加上述混合液 8 μL，用密封條密封試劑板。放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，63 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)。4 ℃終止反應(yīng)。5×Tris-硼酸緩沖液制備20 g·L-1的瓊脂糖凝膠，冷卻至60 ℃時(shí)，每100 mL TBE加2 μL 10 g·L-1的溴化乙錠，電泳槽中鋪好膠后放置梳子，冷卻。去掉PCR試劑板上的密封條，加入6 μL PCR產(chǎn)物于電泳膠孔內(nèi)。以O(shè)NELAMBDA gel box 120V恒壓電泳25 min，將凝膠取出置紫外燈下拍照觀察。

1.7 K562細(xì)胞和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞表面NKG2D配體及HLA-Ⅰ分子的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞和分選的CD34+CD38-KG1a細(xì)胞，PBS洗滌，計(jì)數(shù)，分管，直接標(biāo)記法檢測(cè)HLA-Ⅰ類分子，每106個(gè)細(xì)胞加入1 μg W6/32，4 ℃培育 30 min，PBS洗滌3次。間接標(biāo)記法檢測(cè)NKG2D配體的表達(dá)，每106個(gè)細(xì)胞加入抗MICA/B單抗，抗ULBP1單抗，抗ULBP2單抗，抗ULBP3單抗，抗HLA-Ⅰ 單抗一抗各1 μg，4 ℃下作用30 min，PBS洗滌后再加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(稀釋度1：100)二抗，4 ℃培育30 min，PBS洗滌后上機(jī)，以同型IgG抗體作為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞儀分析1×104個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 CD34+CD38--KG1a和NK細(xì)胞的純度結(jié)果見(jiàn)圖1。分選的CD34+CD38--KG1a細(xì)胞和NK細(xì)胞純度分別為(94.25±2.16)%、(91.70±2.05)%。

A：NK細(xì)胞分選前；B：NK細(xì)胞分選后；C：CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞分選前；D：CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞分選后。

2.2 NK細(xì)胞對(duì)K562和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的殺傷作用結(jié)果見(jiàn)表1。NK細(xì)胞在各效靶比下對(duì)CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的殺傷率均低于K562細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 NK細(xì)胞對(duì)K562和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞殺傷情況

2.3 NK細(xì)胞KIR和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞的HLA-Ⅰ基因分型結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。4例健康個(gè)體NK細(xì)胞KIR基因型KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1和KIR3DL2；CD34+CD38-KG1a細(xì)胞HLA-Ⅰ基因型為A30、30，B51、78，Cw4、16。

圖2 NK細(xì)胞KIR基因分型

圖3 CD34+CD38-KG1a細(xì)胞HLA基因分型

2.4 K562和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞中NKG2D配體及HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)率結(jié)果見(jiàn)表2。K562細(xì)胞高表達(dá)NKG2D配體，CD34+CD38-KG1a細(xì)胞幾乎不表達(dá)NKG2D配體，K562細(xì)胞中NKG2D配體表達(dá)率顯著高于CD34+CD38-KG1a細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；K562細(xì)胞中幾乎不表達(dá)HLA-Ⅰ，CD34+CD38-KG1a細(xì)胞高表達(dá)HLA-Ⅰ，CD34+CD38-KG1a細(xì)胞中HLA-Ⅰ的表達(dá)率顯著高于K562細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 K562和CD34+CD38-KG1a細(xì)胞表面NKG2D配體和HLA-Ⅰ分子的表達(dá)率

3 討論

LSC不僅凋亡相關(guān)基因發(fā)生改變，其免疫原性也發(fā)生了改變(尤其在和免疫系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)抗作用后)，如MHC抗原表達(dá)缺失或降低、黏附分子和共刺激分子表達(dá)下降、抗原加工提呈障礙、低表達(dá)NKG2D配體等，這些免疫原性改變使LSC能夠逃逸免疫細(xì)胞識(shí)別和殺傷，最終發(fā)展為白血病[5]。NK細(xì)胞是機(jī)體的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，在殺傷腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中，無(wú)需特異性抗原提呈，可直接發(fā)揮殺傷作用，比其他免疫細(xì)胞更直接、更迅速，在抗腫瘤免疫中起重要作用，是近年來(lái)過(guò)繼性免疫治療的新星[6]。

NK細(xì)胞的殺傷活性由其表面的活化性受體、抑制性受體傳遞的信號(hào)共同決定。NKG2D是NK細(xì)胞表面的主要活化性受體，其配體為ULBP，目前發(fā)現(xiàn)的成員有 ULBP1、ULBP2、ULBP3和MICA/B[7]。KIR是NK細(xì)胞表面主要抑制性受體，和腫瘤細(xì)胞表面的HLA- I類分子結(jié)合后傳遞抑制性信號(hào)[8]。KIR分子不同，識(shí)別并結(jié)合的HLA-I分子也不同[9]，KIR2DL1識(shí)別HLA-Cw2、Cw4、Cw5和Cw6；KIR2DL2/2DL3識(shí)別HLA-Cw1、Cw3、Cw7和Cw8；KIR3DL1識(shí)別HLA-Bw4；KIR3DL2識(shí)別HLA-A3和A11；其余的KIR配體目前尚未完全明確[10]。NK細(xì)胞通過(guò)其表面2種受體與靶細(xì)胞表面配體相結(jié)合，傳遞不同信號(hào)，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能發(fā)揮。

本研究結(jié)果顯示，CD34+CD38-KG1a細(xì)胞明顯抵抗NK細(xì)胞的殺傷作用，即使在效靶比為20：1時(shí)，殺傷率仍小于15%，而K562細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷作用高度敏感，在同一效靶比時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞殺傷率顯著高于CD34+CD38-KG1a細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，K562細(xì)胞幾乎不表達(dá)HLA-I分子，因此不能與NK細(xì)胞表面KIR受體結(jié)合傳遞抑制性信號(hào)，而活化性配體NKG2D高表達(dá)，導(dǎo)致殺傷信號(hào)明顯增強(qiáng)，故K562細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用高度敏感。而CD34+CD38-KG1a細(xì)胞高表達(dá)HLA-I類分子，能與NK細(xì)胞表面KIR受體結(jié)合，傳遞抑制性信號(hào)；其基因型為A30、30，B51、78，Cw4、16。HLA-Cw4能與NK細(xì)胞表面的KIR2DL1分子識(shí)別；因此，CD34+CD38-KG1a細(xì)胞能通過(guò)Cw4-KIR2DL1途徑向NK細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)。HLA-A30不能識(shí)別KIR3DL2和HLA-B51、78不能識(shí)別KIR3DL1、3DL2 配體，存在錯(cuò)配，傳遞活化信號(hào)；但是其活化性配體NKG2D幾乎不表達(dá)，導(dǎo)致活化性信號(hào)較弱。2種信號(hào)作用NK細(xì)胞后抑制性信號(hào)占優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致CD34+CD38-KG1a細(xì)胞抵抗NK細(xì)胞的殺傷作用。

研究表明，NKG2D配體在白血病細(xì)胞中相對(duì)廣泛的表達(dá)使其在誘導(dǎo)NK細(xì)胞毒性反應(yīng)中起著重要作用，NKG2D配體下調(diào)或丟失可導(dǎo)致LSC抵抗免疫細(xì)胞殺傷作用[11]。LSC逃逸免疫細(xì)胞殺傷作用的能力，一部分是其固有的，一部分是在與免疫細(xì)胞相互作用中獲得的[12]。因此，研究如何恢復(fù)或增強(qiáng)白血病細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)，或者干擾LSC的HLA基因或分子使之與KIR發(fā)生錯(cuò)配，將會(huì)為提高白血病免疫治療效果提供一種新的思路。