周 航，王慧敏，閆義濤，盧振民，李 靖

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科，河南 衛(wèi)輝 453100)

嗅覺功能障礙是神經(jīng)退行性病變的主要表現(xiàn)[1]。嗅覺是人體的重要生理功能之一，正常人群中嗅覺功能障礙的發(fā)病率約為1.2%。嗅覺神經(jīng)細胞是具有再生能力的神經(jīng)元[2]，Nogo受體(Nogo receptor，NgR)是位于神經(jīng)元表面的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NgR與其配體Nogo-A結合后發(fā)揮多種作用，對細胞的增殖、轉移及神經(jīng)的誘導、再生起重要作用[3]。而在嗅覺功能障礙發(fā)生及恢復過程中，NgR及其配體所起的作用尚不清楚，本研究采用TritonX-100建立嗅覺功能障礙小鼠模型，探討NgR及其配體在嗅覺功能障礙發(fā)生及恢復過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8～10周無特定病原體BALB/C小鼠100只，雌雄不拘，體質量25～30 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol試劑盒、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，兔抗鼠Nogo-A單克隆抗體、兔抗鼠NgR單克隆抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔二抗購自上海碧云天生物有限公司，Nogo-A-1酶聯(lián)免疫吸附試驗測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國Sigma公司；BD光學顯微鏡購自深圳博士達光學儀器有限公司，HH-ZKS4電熱恒溫水浴箱購自上海科升儀器有限公司，反轉錄-PCR(reverse transcription- PCR，RT-PCR)儀購自美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 嗅覺功能障礙模型制備及組織標本采集將小鼠隨機分為對照組(n=20)和模型組(n=80)。將Triton X-100用生理鹽水稀釋為體積分數(shù)0.7%的實驗試劑，用鈍頭微量注射器將100 μL體積分數(shù) 0.7% Triton X-100溶液注入模型組小鼠雙側鼻腔，注射速度為100 μL·min-1。對照組小鼠同樣的方法注射100 μL生理鹽水[4]。參照文獻[5]的方法，2組小鼠分別于造模后3、7、21、49 d給予埋藏食物顆粒實驗，記錄覓食時間；小鼠在300 s(5次測試的均值)內未找到食物顆粒即判定嗅覺功能障礙模型建立成功。對照組及模型組小鼠于造模后3、7、21、49 d斷頭處死，收集小鼠嗅上皮組織，一部分于液氮凍存，用于檢測Nogo-A、NgR mRNA和NgR、Nogo-A蛋白的表達，一部分經(jīng)體積分數(shù)10%甲醛溶液固定、常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測。

1.3.2 免疫組織化學法檢測小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白表達取組織切片，室溫復溫 20 min，體積分數(shù)0.3%H2O2常溫孵育30 min；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次5 min；滴加用PBS稀釋的兔抗鼠NgR一抗(1：100)，陰性對照以PBS代替一抗，4 ℃孵育箱中過夜；PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP標記的山羊抗兔二抗(1：1 000)，室溫孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加過氧化物酶標記的鏈霉親和素復合物(1：100)，室溫孵育20 min；PBS 洗3次，每次5 min；用新鮮配制的 3，3′二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，蒸餾水終止顯色；滴加蘇木精復染1 min；漂洗干凈，返藍 5 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片。選取5個視野，每個視野200個細胞，觀察小鼠嗅上皮組織中NgR表達情況，細胞膜褐色部分即為NgR表達，陽性細胞所占比例即為NgR陽性表達率。

1.3.3 RT-PCR檢測嗅上皮組織中Nogo-A及NgR mRNA表達取液氮凍存組織，復溫后采用RT-PCR法檢測Nogo-A、NgR mRNA的表達，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。采用TRIzol提取總RNA，反轉錄cDNA后備用。根據(jù)試劑盒檢測說明用PCR檢測嗅上皮組織中Nogo-A與NgR的表達水平。Nogo-A上游引物序列為5′-CGCTGGT-GCTTCTGTAGTGC-3′，下游引物序列為5′-CTTTGT-GCTGGGCTACTG-3′；NgR上游引物序列為5′-TTCTGACATTAAGGGCCGTG-3′，下游引物序列為5′-CCAGCCCACACTTCTCTCTC-3′；β-actin上游引物序列為5′-CTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，下游引物序列為5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。PCR反應體系：上、下游引物各0.4 μ L，Taq聚合酶 10 μL，模板2 μL，雙蒸水7.6 μL。PCR反應條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，30個循環(huán)。擴增目的基因的同時擴增β-actin基因。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.3.4 Western blot法檢測嗅上皮組織中NgR蛋白表達取液氮凍存組織，復溫后進行研磨，根據(jù)試劑盒說明書提取蛋白，按照 50 μg 蛋白的溶液體積為上樣量，向其中加入5×十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)上樣緩沖液，調為l×SDS，沸水中變性10 min；將預先制備好的聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，AGE)安裝于電泳槽中，加電泳液，用微量進樣器緊貼離心壁加入樣品。樣品經(jīng)質量分數(shù)10%SDS-AGE膠120 V電泳至分離后換 80 V 電泳 60 min，300 mA恒流轉膜45 min；將膜用洗膜緩沖液(tris-buffered saline Tween，TBST)從下至上浸濕后，質量分數(shù)5%脫脂牛奶封閉2 h；TBST洗膜10 min。加入兔抗鼠的抗NgR一抗(1：100稀釋)，4 ℃孵育箱中孵育過夜；洗膜3次，加入相應的山羊抗兔的HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，暗室壓片，曝光，顯影，定影。以兔抗鼠單克隆抗體 β-actin(1：1 000)為內參照，應用Image J 1.49軟件分析Western blot內參條帶與目的條帶的灰度比值。

1.3.5 ELISA測定嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達將嗅上皮組織研碎，按照 10 mg 組織對應100 μL PBS的比例進行勻漿，1 500 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-80 ℃冰箱保存待測。采用ELISA法測定上清液中Nogo-A蛋白表達水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 2組小鼠嗅覺功能比較對照組小鼠覓食時間為(70.1±15.2)s；模型組小鼠造模后3、7、21、49 d 覓食時間分別為(469.2±20.4)、(495.1±31.1)、(290.3±23.3)、(130.6±28.2)s。模型組小鼠造模后3、7、21 d覓食時間長于對照組及造模后 49 d，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組小鼠造模后49 d覓食時間與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 2組小鼠嗅上皮組織中NgR陽性表達率比較結果見圖1。模型組小鼠嗅上皮組織中NgR陽性表達較對照組顯著增強。對照組小鼠嗅上皮組織中NgR陽性表達率為18.19%(30/160)，模型組小鼠造模后3、7、21、49 d嗅上皮組織中NgR陽性表達率分別為61.21%(101/165)、84.85%(140/165)、69.10(114/165)、48.48%(80/165)，模型組小鼠造模后3、7、21、49 d 嗅上皮組織中NgR陽性表達率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=36.235、35.483、41.876、40.908，P<0.05)。

A：對照組；B：模型組造模后3 d；C：模型組造模后7 d；D：模型組造模后21 d；E：模型組造模后49 d。

2.3 2組小鼠嗅上皮組織中NgR、Nogo-A mRNA相對表達量比較結果見表1。模型組小鼠造模后3、7、21、49 d嗅上皮組織中NgR、Nogo-A mRNA相對表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 2組小鼠嗅上皮組織中NgR、Nogo-A mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較aP<0.05。

2.4 2組小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白相對表達量比較結果見圖2。對照組嗅上皮組織中小鼠NgR蛋白相對表達量為0.22±0.04；模型組造模后3、7、21、49 d小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白相對表達量分別為 0.85±0.03、0.87±0.02、0.86±0.02、0.39±0.01。模型組小鼠造模后第3、7、21、49 d嗅上皮組織中NgR蛋白相對表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：對照組；B：模型組造模后3 d；C：模型組造模后7 d；D：模型組造模后21 d；E：模型組造模后49 d。

2.5 2組小鼠嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達比較對照組小鼠嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達量為(30.1±4.5)μg·L-1；模型組小鼠造模后第3、7、21、49 d嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達量分別為(485.2±6.3)、(490.3±5.1)、(243.2±10.1)、(123.6±4.5)μg·L-1。模型組小鼠造模后第3、7、21、49 d嗅上皮與嗅球組織中Nogo-A蛋白表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

嗅覺功能障礙與多種疾病密切相關，且嗅覺功能障礙也是退行性疾病的早期信號，嚴重影響患者的生活質量[6]。嗅覺受體神經(jīng)細胞是具有再生能力的神經(jīng)元，雖然嗅覺功能障礙的治療取得了一定效果，但是仍有部分患者的嗅覺功能難以得到改善。嗅覺功能障礙的機制仍不十分清楚。Nogo蛋白是髓磷脂相關生長抑制蛋白的一種，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生中發(fā)揮重要作用[7]。Nogo-A是含有1 163個氨基酸的大蛋白分子[8]，是Nogo的重要組成部分[9]。Nogo-A通過與NgR在神經(jīng)纖維上結合而抑制其再生。本研究采用體積分數(shù)0.7%的Triton X-100建立小鼠嗅覺障礙模型，該模型未毀壞嗅上皮的基底膜，所以嗅覺可恢復，可以動態(tài)觀察嗅覺功能障礙小鼠的嗅覺變化過程。本研究結果顯示，造模后3 d，模型組小鼠的覓食時間明顯延長，且大于300 s，說明造模成功。造模后21 d，模型組小鼠的覓食時間開始較之前縮短，小鼠的功能障礙開始恢復；造模后49 d，模型組小鼠覓食時間與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，與王淵等[10]報道結果一致。

NgR是一種磷脂酰肌醇錨定蛋白，位于神經(jīng)元的表面，是神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的重要抑制因子[11]，與其受體結合后可以抑制軸突的生長、延長。本研究通過免疫組織化學法對NgR進行定性定量分析發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白表達增加，在嗅覺恢復過程中NgR蛋白表達有所減少。通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠造模后3、7 d嗅上皮組織中Nogo-A mRNA的表達明顯升高，造模后21、49 d雖有所下降，但仍明顯高于對照組。ELISA檢測Nogo-A的表達得出相似的結果，提示NgR參與神經(jīng)損傷及修復過程，從而參與嗅覺障礙過程。在既往的研究中，炎癥及腦損傷后NgR及其配體可影響星形膠質細胞的形態(tài)，從而影響腦損傷的恢復過程[12]，調節(jié)NgR信號通路可使腦損傷后軀體協(xié)調能力、認知功能等得到恢復，提示NgR參與了腦損傷的恢復過程。這與本研究結果相一致。而Nogo-A在炎癥反應中可促進經(jīng)背根神經(jīng)節(jié)傳導的熱痛覺過敏[13]，也可以與NgR作用后通過調節(jié)PC12 細胞中的WNK1信號通路來抑制神經(jīng)元軸突的延長，從而影響神經(jīng)損傷的恢復過程[14]。另一方面，Nogo-A在缺血性中樞系統(tǒng)疾病中抑制了血管的再生，抗Nogo-A 抗體可以保護神經(jīng)元免遭缺血損傷，加快血管修復，提高血流灌注，從而為神經(jīng)系統(tǒng)的修復提供營養(yǎng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A表達水平在小鼠嗅覺障礙模型中升高，隨著嗅覺障礙功能的恢復Nogo-A表達水平下降。另有研究表明，在大鼠模型中，電針刺激大腦缺血灶可通過下調 Nogo-A/NgR信號通路的作用為軸突再生提供低水平的抑制環(huán)境[16]，促進神經(jīng)修復；阻斷Nogo-A與NgR的作用后可以促進神經(jīng)元功能恢復[17]從而促進神經(jīng)生長及延長；說明NgR及其配體Nogo-A參與了神經(jīng)修復的過程，下調NgR及其配體Nogo-A的表達及阻斷其相互作用可能促進小鼠嗅神經(jīng)元恢復及嗅覺障礙改善。

綜上所述，在小鼠嗅覺障礙模型中，小鼠嗅上皮組織中NgR與Nogo-A表達增加，Nogo-A與NgR結合后可能參與嗅覺障礙的發(fā)生、發(fā)展。下調NgR及其配體Nogo-A的表達并阻斷其相互作用，有望為嗅覺障礙的治療提供一個新思路。