章佳斌，盧曉文，羅少杰，焦 鈺，鄧岳文,2

馬氏珠母貝DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的克隆及表達(dá)

章佳斌1，盧曉文1，羅少杰1，焦 鈺1，鄧岳文1,2

(1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江，524025）

對馬氏珠母貝（）DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）的基因全長及組織表達(dá)作分析，探究馬氏珠母貝甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1（）參與貝殼礦化調(diào)控機(jī)理。利用RACE技術(shù)獲得的cDNA序列全長，并對的序列特征進(jìn)行分析，同時利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR技術(shù)檢測馬氏珠母貝不同組織中的表達(dá)情況?；騝DNA長4 818 bp，其中，開放閱讀框為4 623 bp，編碼1 540個氨基酸。預(yù)測分子質(zhì)量約為174.55 ku、理論等電點為5.89。結(jié)構(gòu)域分析顯示，PmDnmt1具有DMAP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)、BAH結(jié)構(gòu)域和C5胞嘧啶DNA甲基化酶結(jié)構(gòu)域等。多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dnmt1在不同物種間具有較高保守性。實時熒光定量PCR分析顯示在所有檢測組織中均有表達(dá)，在外套膜中央膜部分的表達(dá)量最高（< 0.05）。可通過調(diào)控外套膜的DNA甲基化修飾參與貝殼的形成。

馬氏珠母貝；DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶；基因克??；表達(dá)模式

DNA甲基化是目前在表觀遺傳學(xué)中研究最為成熟的一種表觀遺傳修飾，能夠引起DNA穩(wěn)定性、構(gòu)象、染色體結(jié)構(gòu)等多方面的改變，在調(diào)控基因表達(dá)[1]、維持染色體結(jié)構(gòu)[2]以及基因印跡[3]等方面扮演著重要角色。通常來說，DNA甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）起介導(dǎo)作用，并利用腺苷酰--甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC）[4]。哺乳動物中，3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3）參與到DNA的甲基化修飾中。Dnmt3分為Dnmt3a和Dnmt3b兩種，能夠識別半甲基化和未甲基化序列，與DNA序列的從頭甲基化有關(guān)；而Dnmt1能夠以Dnmt3a/b修飾產(chǎn)物單鏈甲基化為模板，進(jìn)而形成雙鏈甲基化，其主要功能是維持基因組已有的甲基化模式，在配子形成期和胚胎早期的甲基化模式的形成發(fā)揮重要作用[5-6]。

已有研究表明無脊椎動物基因組的甲基化修飾參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性[7]、外顯子的選擇性剪接[8]和早期發(fā)育活動[9]等。近年來，貝類甲基化模式也受到關(guān)注。研究表明不同家系的馬氏珠母貝閉殼肌的甲基化水平與模式存在差異，近交家系的組織甲基化水平顯著高于雜交家系的組織甲基化水平[10]。馬氏珠母貝外套膜不同區(qū)域的甲基化存在顯著差異，其組織間的甲基化水平由高到底依次是中央膜＞邊緣膜＞套膜[11]。對牡蠣發(fā)育過程的甲基化研究發(fā)現(xiàn)[12]，在牡蠣的胚胎發(fā)育和幼蟲變態(tài)過程中其基因組差異甲基化區(qū)域受到強(qiáng)有力的調(diào)控，羅少杰等[13]發(fā)現(xiàn)牡蠣在感染帕金蟲之后，其鰓與消化道的DNA甲基化水平顯著低于對照組，這表明DNA甲基化在貝類免疫中起到一定的作用。

近些年對貝類甲基化的研究逐漸深入，但貝類基因組甲基化形成與調(diào)控的具體機(jī)制還尚未闡明，對于在貝類基因組甲基化作用的研究也未見報道。因此，本研究通過首次克隆獲得馬氏珠母貝基因，并檢測其組織表達(dá)情況，以期為探究基因與貝類基因組甲基化關(guān)系，進(jìn)一步探索無脊椎動物DNA甲基化修飾對基因表達(dá)調(diào)控作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用養(yǎng)殖于廣東省湛江市徐聞縣大井村海域（海域鹽度約為31，pH為8.2）的“海選1號”馬氏珠母貝（）為實驗用貝，清除貝體表面附著物暫養(yǎng)2 d后取樣，樣品置于液氮中保存。RACE擴(kuò)增所用材料為馬氏珠母貝的外套膜，用于熒光定量PCR的材料取自馬氏珠母貝外套膜的邊緣膜（Mantle edge，ME）、套膜（Mantle pallial，MP）、中央膜（Mantle central，MC）、閉殼?。ˋdductor muscle，A）、鰓（Gill，Gi）、足（Foot，F(xiàn)）、肝胰臟（Hepatopancreas，He）、性腺（Gonads，Go）、血細(xì)胞（Hemocyte，B）。感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本實驗室保存。

1.2 引物信息

見表1。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 將馬氏珠母貝各組織參照Trizol試劑說明書進(jìn)行RNA的抽提；參照寶生物工程（大連）有限公司的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）說明書進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

1.3.2 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶基因的全長cDNA的獲得 根據(jù)馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)[14]，利用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計引物，用于中間片段驗證和5′端和3′端的獲得。參照TaKaRa公司SMARTTM RACE cDNA Amptification Kit的說明書獲得用于RACE的cDNA模板。利用3′RACE 的巢式引物依次擴(kuò)增3′末端序列，第1輪PCR反應(yīng)體系：Premix TaqTM 5 μL，UPM引物0.4 μL，outer引物0.4 μL，cDNA第一鏈0.4 μL，ddH2O 3.8 μL；第2次PCR反應(yīng)體系引物更換為NUP引物和inner引物。隨不同引物理論m值調(diào)整與其相應(yīng)的退火溫度，PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，退火30 s，72 ℃延伸 3 min，35 個循環(huán)；72 ℃保溫10 min；4 ℃保存。5′末端序列擴(kuò)增同樣同巢式PCR獲得，方法同3′末端序列。

表1 研究所用引物

PCR產(chǎn)物先通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，后根據(jù)純化回收試劑盒說明書純化目的基因片段；純化后的基因片段與PMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖菌擴(kuò)增后，經(jīng)菌液PCR得到陽性單克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件將的中間片段與5′端和3′端片段進(jìn)行拼接，即獲得了其全長cDNA。根據(jù)所獲得的基因全長，使用在線BLAST網(wǎng)站對基因的同源性和相似性進(jìn)行比對；使用在線網(wǎng)站工具ORF Finder預(yù)測基因的開放閱讀框；使用ExPASy分析蛋白的理化性質(zhì)；使用PSITE V1分析氨基酸序列功能位點；使用SignalP 4.1和Cell-Ploc預(yù)測基因的信號肽與細(xì)胞定位；使用SMART和ScanProsite預(yù)測基因的結(jié)構(gòu)域；使用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白的空間結(jié)構(gòu)；使用Prabi進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用EMBL在線工具Clustal Omega進(jìn)行多序列比對；使用MEGAX軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3.4 熒光定量檢測組織差異表達(dá)分析 以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT相對定量分析法，檢測在馬氏珠母貝各組織中的表達(dá)，反應(yīng)體系和程序參照Life Technologies Corporation 公司的SYBR Select Master Mix 說明書。熒光定量PCR結(jié)果用ABI step one Software 分析，樣本重復(fù)性和組間差異性用SPSS19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的基本特征

2.1.1序列特征分析 使用RACE技術(shù)獲得基因序列（GenBank登錄號：MN159188），圖1可知，全長為4 818 bp，其中5′UTR為69 bp，3′UTR為126 bp，其中開放閱讀框4 623 bp，共編碼1 540個氨基酸。預(yù)測多肽分子質(zhì)量174.54 ku、等電點為5.89。

起始密碼子（atg）和終止密碼子（tga）用小寫字母表示；下劃線部分代表DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域；雙下劃線部分代表鋅指結(jié)構(gòu)；波浪線部分代表BAH結(jié)構(gòu)域；虛下劃線部分代表DMAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域；灰色背景部分表示C5胞嘧啶特異性DNA甲基化酶結(jié)構(gòu)域；

2.1.2 PmDnmt1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 ExPASy預(yù)測帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp和Glu）為253個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg和Lys）為230個；不穩(wěn)定系數(shù)為49.04，為不穩(wěn)定蛋白；親水性平均系數(shù)為-0.763，即為親水性蛋白。通過PSITE V1對氨基酸序列的功能位點進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有4個N-糖基化位點，3個cDNA和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點，26個蛋白激酶C磷酸化位點，31個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，9個酪氨酸激酶磷酸化位點，15個N-豆蔻?；稽c，2個酰胺化位點和23個微體C-端信號序列。SignalP 4.1分析顯示沒有信號肽，且通過Cell-Ploc分析發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在細(xì)胞核。通過SMART和ScanProsite蛋白質(zhì)分析工具和發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列在第10~57位上為DMAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第294~429位上為DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域，第523~569位上為鋅指結(jié)構(gòu)（CXXC-type），第640~766位和821~989均為BAH結(jié)構(gòu)域，第1 034~1 488位上為C5胞嘧啶特異性DNA甲基化酶結(jié)構(gòu)域（圖2）。在Prabi在線網(wǎng)站上對基因進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示：α螺旋30.97 %、β折疊4.61 %、延伸鏈15.06 %、無規(guī)則卷曲49.35 %。采用SWISS-MODEL軟件預(yù)測PmDnmt1蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)，與太平洋牡蠣Dnmt1結(jié)構(gòu)存在較高的相似性（圖3）。

圖2 PmDnmt1結(jié)構(gòu)域示意圖

A：馬氏珠母貝；B：太平洋牡蠣

2.1.3 PmDnmt1與其他物種的同源性分析 以EMBL在線工具Clustal Omega將PmDnmt1與太平洋牡（）、美洲牡蠣（）、蝦夷扇貝（）、擬球海膽（）密西西比鱷（）的Dnmt1的氨基酸進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)構(gòu)顯示物種間的Dnmt1具有較高的相似性（圖4）。以馬氏珠母貝、太平洋牡蠣、蝦夷扇貝、擬球海膽、家蠶（、斑馬魚（）、密西西比鱷、綠海龜（）、褐家鼠（）和人（）的Dnmt1氨基酸序列為基礎(chǔ)，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，馬氏珠母貝和太平洋牡蠣聚為一簇，并與蝦夷扇貝聚在同一分支上；人和褐家鼠聚為一簇，并于密西西比鱷、綠海龜和斑馬魚聚在同一分支上（圖5）。

2.2 組織表達(dá)差異分析

應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)分析在組織中的表達(dá)量，所用組織分別為：外套膜的邊緣膜（ME）、套膜（MP）、中央膜（MC）、閉殼肌（A）、鰓（Gi）、足（F）、肝胰臟（He）、性腺（Go）、血細(xì)胞（B）等九個組織。實驗結(jié)果表明在馬氏珠母貝的各個組織中均有表達(dá)，其中在中央膜上的表達(dá)量最高（< 0.05），在血淋巴中表達(dá)量最低（< 0.05），在余下7個組織中表達(dá)水平較為一致（如圖6）。

保守氨基酸序列以藍(lán)色陰影標(biāo)準(zhǔn)

圖5 PmDnmt1氨基酸序列聚類分析

ME：邊緣膜；MP: 套膜；MC：中央膜；A：閉殼?。籊i：鰓；F:足； He: 肝胰臟；Go:性腺；B：血細(xì)胞；

3 討論

DNA甲基化是一種常見的復(fù)制后修飾，參與生物機(jī)體內(nèi)諸如調(diào)控基因表達(dá)、染色體結(jié)構(gòu)維持、生長發(fā)育等多種重要生理過程的現(xiàn)象，主要由甲基轉(zhuǎn)移酶行使DNA甲基化修飾功能。本實驗通過RACE技術(shù)成功獲得基因序列全長，為4 818 bp，共編碼1 540個氨基酸。多序列比對分析結(jié)果顯示PmDnmt1與不同物種中的Dnmt1的比對結(jié)果中呈現(xiàn)較高的保守性。一般認(rèn)為Dnmt1序列可以分為兩個區(qū)域N端蛋白識別區(qū)、C端催化區(qū)，其余位置上包含有半胱氨酸位點、BAH結(jié)構(gòu)、鋅離子結(jié)合點等起到錨定蛋白和形成DNA甲基化等作用[15-16]。SMART預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)具有DMAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)、BAH結(jié)構(gòu)和C5胞嘧啶特異性DNA甲基化酶結(jié)構(gòu)域等。DMAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于PmDnmt1的N端，在哺乳動物中，Dnmt1通過該位點與DMAP1（一種轉(zhuǎn)錄抑制因子）形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制[17]，因此，可以推測PmDnmt1也具有轉(zhuǎn)錄抑制的功能。N端的DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域與亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)結(jié)合和催化功能有關(guān)，研究表明，Dnmt1與裸露DNA和多核小體的結(jié)合活性受到DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域的抑制，DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合催化域而排除DNA發(fā)揮作用[18]。此外，PmDnmt1的鋅指結(jié)構(gòu)為CXXC類型，該結(jié)構(gòu)域包含8個保守的半胱氨酸殘基，能與2個鋅離子結(jié)合，是與非甲基化CpG二核苷酸結(jié)合的位點[19]。這些典型結(jié)構(gòu)域使得甲基轉(zhuǎn)移酶具有穩(wěn)定而廣泛的作用位點，進(jìn)而更好地調(diào)控基因表達(dá)。

為了更好探究馬氏珠母貝甲基轉(zhuǎn)移酶在組織中的作用，使用實時熒光定量PCR結(jié)果顯示該基因mRNA在各個組織中均有表達(dá)，在中央膜中的表達(dá)量最高。外套膜是貝殼形成的主要器官，其不同區(qū)域所具有的結(jié)構(gòu)特征和功能具有差異。貝殼按照形成的方式和組織的結(jié)構(gòu)不同可分為3層，由內(nèi)到外依次是珍珠質(zhì)層，棱柱層及角質(zhì)層。珍珠層是由中央的上皮細(xì)胞分泌形成，以文石為主；棱柱層結(jié)構(gòu)由邊緣膜分泌形成，以方解石為主；角質(zhì)層結(jié)構(gòu)由外套膜的外、中褶殼皮溝細(xì)胞分泌形成。研究發(fā)現(xiàn)與貝殼棱柱層形成有關(guān)的基因通常在邊緣膜高表達(dá)，與貝殼珍珠層形成相關(guān)的基因則在中央膜和套膜區(qū)高表達(dá)[20]。馬氏珠母貝外套膜不同區(qū)域其DNA甲基化水平不一[11]，而在維持基因組的甲基化水平起到重要作用，且影響到胚胎發(fā)育[21]、器官功能分化[22]與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)合與貝殼珍珠層形成相關(guān)的礦化基因普遍在中央膜和套膜上高表達(dá)[22]，推測礦化基因的高表達(dá)需要DNA甲基化等表觀遺傳修飾參與調(diào)控，因而有可能通過維持甲基化修飾參與調(diào)控貝殼珍珠層的形成。

4 結(jié)論

本研究首次利用RACE技術(shù)從馬氏珠母貝克隆獲得基因cDNA全長序列，該基因在馬氏珠母貝外套膜中央膜中表達(dá)量最高，推測可能參與外套膜貝殼礦化基因的調(diào)控。

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Molecular Cloning and Expression Analysis of DNA Methyltransferase 1 () from

ZHANG Jia-bin1, LU Xiao-wen1, LUO Shao-jie1, JIAO Yu1, DENG Yue-wen1,2

(1.,524088,;2.,524025,）

【】In order to offer a theoretical basis for exploring the regulation of DNA methyltransferase 1 of() in biomineralization, the full-length gene was obtained and the tissue expression pattern ofwas elucidated. 【】The cDNA sequence ofwas obtained by rapid amplification of cDNA ends technology (RACE). The characteristics ofwere analyzed, and the mRNA expression ofin different tissues ofwere detected by fluorescence quantitative PCR. 【】The results showed that the length ofwas 4 818 bp,including ORF 4 623 bp which encoded 1 540 amino acids. The predicted molecular weight was about 174.55 ku and the theoretical isoelectric point was 5.89. The result of domain prediction analysis showed thathad DMAP binding domain, Dnmt1RFD, zinc finger structure, BAH domain and c-5 cytosine-specific DNA methylase domain profile. The multi-sequence alignment results showed that Dnmt1 was highly conserved across different species. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed thatgene was expressed in all test tissue, with the highest expression in the mantle central (< 0.05).may be involved in shell formation through regulating the DNA methylation.

; DNA methyltransferase; gene clone; expression pattern

Q78

A

1673-9159（2019）05-0016-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.003

2019-04-20

國家自然科學(xué)基金（31672626）

章佳斌，男，碩士研究生，研究方向為珍珠培育與加工。E-mail:874788088@qq.com

鄧岳文，教授，研究方向為珍珠貝遺傳育種與養(yǎng)殖。E-mail：dengyw@gdou.edu.cn

章佳斌，盧曉文，羅少杰，等. 馬氏珠母貝DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的克隆及表達(dá)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2019，39（5）：16-23.

（責(zé)任編輯：劉朏）