楊敏志，李長玲，黃翔鵠，王清珍，陳愛珊

氮濃度、溫度和照度對波吉卵囊藻繁殖模式的影響

楊敏志1,2,3，李長玲1,2,3，黃翔鵠1,2,3，王清珍2,3，陳愛珊2,3

（1. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518000；2. 廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；3. 廣東省藻類養(yǎng)殖及應用工程技術研究中心，廣東 湛江 524025）

【】探索波吉卵囊藻（）的繁殖模式，調控其生殖過程以實現藻生物質穩(wěn)定增長。在熒光顯微鏡下觀察波吉卵囊藻似親孢子形成過程，探究溫度、照度、氮濃度對其繁殖模式的影響。波吉卵囊藻以2、4和8似親孢子型模式繁殖，在藻細胞第二輪分裂過程中因分裂不同步，有時也形成3個似親孢子。氮限制和弱光顯著影響波吉卵囊藻繁殖模式（< 0.05）。通常情況下，波吉卵囊藻以4似親孢子型繁殖模式繁殖，但在缺氮和弱光下2和3似親孢子型模式的頻率上升。在15 ~ 35 ℃溫度范圍內，波吉卵囊藻繁殖模式變化不大。波吉卵囊藻有4種繁殖模式。在不良環(huán)境中，2和3似親孢子型模式頻率上升。

波吉卵囊藻；似親孢子；繁殖模式

藻類繁殖規(guī)律是藻類學研究的重要內容，也是藻類培養(yǎng)的理論基礎。約在60 a前，Tamiya等首次實現小球藻（sp.）的同步化培養(yǎng)[1]，并用于細胞周期的生化和生理分析。同時，Howard和Pelc第一次將細胞周期劃分為G1、S、G2和M四個階段[2]。此后，相繼建立了柵藻（sp.）和衣藻（sp.）等綠藻的典型細胞周期模型[3-6]。與多數其他真核生物不同，綠藻通常在一個細胞周期中進行多輪細胞物質復制，多重分裂后，母細胞通常形成2個子細胞（是從1到10的整數），子細胞數量受環(huán)境條件影響[7,8]。波吉卵囊藻（）是一種綠藻，無性生殖，通常由2、4和8個細胞形成細胞群，群體外有一層明顯膠質包被[9]，因而種群穩(wěn)定、適應能力強。定向培育可輔助波吉卵囊藻搶占養(yǎng)殖水體生態(tài)位，有效降低水體氨氮、亞硝態(tài)氮等有害物質濃度，廣泛用于養(yǎng)殖水域生態(tài)調控[10-12]。但在波吉卵囊藻生物學研究方面進展緩慢，Snow[13]發(fā)現，波吉卵囊藻細胞通過二分裂和多重分裂形成2、4或8個似親孢子，子代細胞包裹在母細胞殘留的細胞壁中。本研究利用波吉卵囊藻這一特性，以群體中細胞數量代表細胞繁殖模式，探究氮濃度、溫度、光照對其細胞繁殖模式的影響，描述其繁殖規(guī)律，并補充波吉卵囊藻孢子形成過程，為波吉卵囊藻的池塘定向培育提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 藻種

實驗用波吉卵囊藻由廣東海洋大學水產學院藻類資源開發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)條件

波吉卵囊藻接種于無菌改良培養(yǎng)基[14,15]。波吉卵囊藻置于恒溫光照培養(yǎng)箱中以設定基本培養(yǎng)條件培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25 ± 1）℃，光暗比12D∶12L，照度2 500 lx，pH值7.9 ~ 8.0，為確保海水中不含任何營養(yǎng)鹽，實驗用海水均為基于 Harrison經典配方配制的人工海水，鹽度控制在28 ± 1。

1.3 波吉卵囊藻的細胞繁殖模式

在波吉卵囊藻培養(yǎng)至暗周期后，定時取1 mL藻液，用體積分數2.5%戊二醛處理4 h，離心收集藻細胞，用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2次，用終質量濃度20 μg/mL的SYBR Green I（497 nm，520 nm）或DAPI（340 nm，488 nm）避光染色20 min，裝片，于Nikon倒置熒光顯微鏡Ti-E上觀察波吉卵囊藻藻體形態(tài)和細胞分裂時葉綠體（440 nm，680 nm）、細胞核變化，并拍照。

1.4 不同培養(yǎng)條件下各細胞繁殖模式的頻率分布

基于基礎培養(yǎng)條件進行不同條件對細胞繁殖模式影響的單因素實驗。氮濃度梯度設計為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L；照度梯度設計為0、1 000、2 000、3 000、4 000 lx；溫度梯度設計為15、20、25、30、35 ℃。初始接種濃度為每毫升5 × 104個藻細胞，每個處理設置3個重復實驗。培養(yǎng)期間每天定時搖瓶3 ~ 4次。波吉卵囊藻培養(yǎng)至光周期6 h后細胞分裂基本完成，子細胞包裹在母細胞膠化膨大的細胞壁中，形成孢子囊狀結構。每24 h采集5 mL藻懸液，持續(xù)168 h。采集的樣本制片后，于顯微鏡下計數，以孢子囊中細胞數目作為判斷細胞繁殖模式的依據。每個樣品計數100個孢子囊，最后取3個重復的平均值。

1.5 數據分析

使用Excel統(tǒng)計、作圖，統(tǒng)計軟件SPSS 19.0分析各模式的頻率與環(huán)境因子的相關性，利用Adobe illustrator CC 2018繪制細胞繁殖模式示意圖。

2 實驗結果

2.1 波吉卵囊藻的細胞繁殖模式

一般情況下，波吉卵囊藻多以二分裂的方式繁殖，通常是同步且連續(xù)的兩輪分裂，形成4個似親孢子（圖1，圖2：c1-c3）；少數只分裂1次，形成2個似親孢子（圖1，圖2：a1-a3）；或在第2輪分裂過程中，部分原生質團脫離分裂進程，最終形成3個似親孢子（圖1，圖2：b1-b3）。極少數的波吉卵囊藻在分裂前期先經過多輪的細胞核分裂后形成多核巨細胞，近球形，體積遠大于其他細胞繁殖模式下的母細胞，隨后原生質分裂，在細胞核周圍產生分裂溝（cleavage furrow），細胞分裂結束后形成8個似親孢子（圖1，圖2：d1-d3）。

圖1 波吉卵囊藻細胞繁殖模式

Fig. 1 Diagrammatic representation of different types of reproduction patterns found in O. borgei

a-d: 波吉卵囊藻的4種細胞繁殖模式； a1-a3: 2似親孢子型；b1-b3: 3似親孢子型； c1-c3: 4似親孢子型；d1-d3: 8似親孢子型；a2-d2: 與a1-d1對應的熒光圖片，黃綠色為 SYBR Green I，藍色為DAPI，紅色為葉綠素自發(fā)熒光。 a-d: four types of reproduction pattern found in O. borgei; a1-a3: two-autospore type; b1-b3: three-autospore type; c1-c3: four autospore type; d1-d3: eight-autospore type; a2-d2, the fluorescence images corresponding to a1-d1, SYBR Green I in yellow-green, DAPI in blue and chlorophyll spontaneous fluorescence in red 圖2 波吉卵囊藻的細胞繁殖模式觀察 Fig. 2 The types of the reproduction pattern found in O. borgei

2.2 氮濃度對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響

不同氮濃度條件下，波吉卵囊藻細胞繁殖模式的頻率分布如圖3所示。在不同氮濃度下波吉卵囊藻均以4似親孢子型的細胞繁殖模式為主，占40 %以上。在氮素消耗殆盡后，波吉卵囊藻無法維持4似親孢子型的繁殖模式，2和3似親孢子型的頻率上升，4似親孢子型頻率下降。1 mmol/L和2 mmol/L組出現極少數8似親孢子型，頻率在1% ~ 2%之間。

圖3 不同氮濃度條件下各細胞繁殖模式所占比例隨培養(yǎng)時間的變化 Fig. 3 Frequency of cell reproductive patterns under different nitrogen concentration culture conditions changed with culture time

2.3 照度對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響

圖4表明，波吉卵囊藻的細胞繁殖模式以4似親孢子型為主。在黑暗環(huán)境下，4似親孢子型的頻率隨時間增加而下降，2似親孢子的頻率隨時間增加而上升，在1 000 ~ 4 000 lx的照度下，4似親孢子型的頻率隨強度增加而升高。

圖4 不同照度條件下細胞繁殖模式所占比例隨培養(yǎng)時間的變化 Fig. 4 Frequency of cell reproductive patterns under different light intensity culture conditions changed with the culture time

2.4 溫度對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響

溫度對波吉卵囊藻繁殖模式的影響如圖5所示，5個溫度處理下，波吉卵囊藻均以4似親孢子型的繁殖模式為主，且頻率隨時間的增加而增加，但在15 ℃時，4似親孢子型的頻率增長速率顯著低于其他組（P < 0.05）。

圖5 不同溫度條件下各細胞繁殖模式所占比例隨培養(yǎng)時間的變化 Fig. 5 Frequency of cell reproductive patterns under different temperature culture conditions changed with the culture time

3 討論

3.1 波吉卵囊藻的細胞繁殖模式

綠球藻目藻類的主要繁殖方式是孢子繁殖，即通過產生似親孢子的方式進行無性生殖，親代細胞在二分裂或多重分裂后，產生2n（n為整數）個子細胞。Borowitzka等[16]根據二分裂和多重分裂將微藻劃分為兩種周期類型，又以細胞核分裂發(fā)生的順序，分為連續(xù)型（consecutive pattern）和聚合型（clustered pattern）（以柵藻和衣藻為代表）。波吉卵囊藻在2似親孢子型和4似親孢子型的形成過程中，細胞核分裂發(fā)生在細胞分裂后期，屬于聚合型的細胞周期，與衣藻類似。而8似親孢子型則先通過細胞核連續(xù)3輪分裂后，形成多核母細胞，隨后在細胞核附近產生分裂溝，形成8個子細胞，這與柵藻相似，屬于連續(xù)型的細胞周期。除2、4和8似親孢子型的繁殖模式外，波吉卵囊藻的3似親孢子型繁殖模式是第1次被描述，這一現象普通小球藻(Chlorella vugaris)[17,18]同樣存在，可能是由于母細胞在第2輪分裂形成4似親孢子的過程中，其中一個原生質團脫離了分裂進程，最終形成3個似親孢子。

選取本院收治的患者88例作為研究對象，將其分為兩組，各44例。其中，護理組男20例、女24例，年齡26～90歲，平均（52.28±4.19）歲，疾病類型：顱腦外傷16例、腦積水10例、腦膿腫14例、其他4例；對照組男21例、女23例，年齡21～88歲，平均（52.40±3.97）歲，疾病類型：顱腦外傷15例、腦積水11例、腦膿腫13例、其他5例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.2 氮濃度對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響

氮是限制微藻細胞生長最重要的營養(yǎng)因子，是影響細胞生長和代謝的重要因素。Olson等[19]研究表明，在缺氮條件下，卡特前溝藻（Amphidinium carteri）的細胞周期滯留在G1期。Vaulot[20]在研究威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogi）和卡氏膜球藻（Hymenomonas carterae）時也得出相同結論。波吉卵囊藻在缺氮環(huán)境中，4似親孢子型的頻率下降，2似親孢子型和3似親孢子型的頻率上升，可能是由于氮供給不足，導致細胞物質合成量不足，細胞無法達到獲得更多的承諾點(commitment point)，一個細胞周期內只完成一次二分裂，或者“不完全”的多重分裂，繁殖模式與卡特前溝藻等真核藻類的氮限制響應是一致的。

3.3 照度對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響

綠藻是一類光能自養(yǎng)型生物，光是其重要能量來源，對細胞周期起重要調節(jié)作用。早在20世紀60年代，已有大量文獻報道照度對小球藻、鏈帶藻（Desmodesmus sp）、柵藻和衣藻同步化培養(yǎng)的影響[21-26]。如Zachleder[27]在卵配衣藻（Chlamydomonas eugametos）的同步培養(yǎng)中發(fā)現，隨著照度的增加，細胞周期的持續(xù)時間明顯縮短，細胞分裂次數也從2次增加至4次。Vítová[28]也報道了萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）子細胞數量從最低照度的2個子細胞增加到最高照度的16個。波吉卵囊藻在黑暗環(huán)境中4似親孢子型的頻率下降，2似親孢子型的頻率上升，表明波吉卵囊藻在光限制的情況下，細胞物質合成受阻；波吉卵囊藻在1 000 lx的照度下，4似親孢子型的頻率開始平緩上升，也表明波吉卵囊藻細胞物質的合成在弱光條件下即可完成。

首先，全面收集區(qū)域概況資料、土壤污染源資料、土壤環(huán)境和農產品資料及其對應的圖件資料等，并通過分析，研究有關信息劃分區(qū)域內的地理單元，為污染風險評價提供基礎支撐；其次，通過評估土壤及農產品調查點位的土壤重金屬污染情況、農產品重金屬污染情況，反映該點位土壤和農產品重金屬污染狀況，劃分點位土壤重金屬風險等級，為區(qū)域風險評價提供基礎依據；最后，通過評價單元內土壤重金屬污染風險、農產品重金屬危害風險、重金屬生物可利用性等因素的情況，反映區(qū)域內耕地土壤和農產品重金屬污染情況，劃分區(qū)域內土壤重金屬風險等級，為重金屬污染耕地分級管理提供依據。

3.4 溫度對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響

溫度的變化影響細胞的整個新陳代謝。Morimura[29]利用橢球小球藻（Chlorella ellipsoidea）完成了描述溫度影響細胞周期同步化的第一份報告。他觀察到兩個有趣的現象：不同溫度下的生長速度不同，細胞分裂持續(xù)的時間也不同；然而，在所有的溫度條件下，細胞均分裂成4個子細胞。這一現象在其他藻類中得到了反復驗證：溫度影響藻細胞的生長速度，細胞周期隨著溫度的升高而縮短[27,30]。波吉卵囊藻在10 ~ 32 ℃均可正常生長繁殖，最佳的培養(yǎng)溫度在25 ~ 30 ℃[31]。從本研究可見，20 ~ 35 ℃對波吉卵囊藻細胞繁殖模式的影響不大，說明波吉卵囊藻有很好的溫度適應性。15 ℃時4似親孢子的頻率及上升幅度低于其他組，暗示著15 ℃時細胞周期持續(xù)時間比其他組長，這與Morimura等[29]的結果相符。

4 結論

波吉卵囊藻存在2似親孢子型、3似親孢子型、4似親孢子型和8似親孢子型4種細胞繁殖模式。在氮限制和缺乏光照時，主要以產生2或3個似親孢子的方式擴大種群。

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Influences of Nitrogen Concentration, Light Intensity and Temperature on the Cell Reproductive Pattern of Oocystis borgei

YANG Min-zhi1,2,3, LI Chang-ling1,2,3, HUANG xiang-hu1,2,3, WANG Qing-zhen2,3, CHEN Ai-shan2,3

（1. Shenzhen Research Institute, Guangdong Ocean University, Shenzhen 518000, China; 2. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 3. Guangdong Research Center for Algae Culture and Applied Engineering, Zhanjiang 524025, China）

Abstract:【Objective】To explore the cell reproductive pattern of Oocystis borgei, regulate its reproductive process, and realize a stable growth of O. borgei. 【Method】Under the fluorescence microscope, the reproductive process of O. borgei was observed, and the effects of temperature, light intensity and nitrogen concentration on its reproductive pattern were investigated. 【Results】Four types of reproductive pattern were found in O. borgei, namely the two, four, eight autospore types and three sporozoites. Three autospore types occasionally formed through asynchronous splitting in the second round of cell division. Nitrogen limitation and weak light significantly affectedthe cells reproductive pattern of O. borgei (P < 0.05). In general, O. borgei proliferates through popularity, forming four daughter cells with the frequencies of two and three autospore types that increased under conditions of nitrogen deficiency and at low light intensity. Temperature affected the reproductive pattern of O. borgei insignificantly.【Conclusion】There were 4 types of reproductive pattern in O. borgei, and the frequencies of two and three autospore types increased in the environment different from the favorite. The type frequencies of the cell reproductive pattern of O. borgei may aid in estimating its growth performance.

Key words：Oocystis borgei; autospore; reproduction pattern

中圖分類號：S968.41+9

文獻標志碼：A

文章編號：1673-9159（2019）05-0044-06

doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.007

收稿日期：2019-02-25

基金項目：活性微藻制品產業(yè)化關鍵技術的研究與示范（KY20180112）；廣東海洋大學博士啟動項目

第一作者：楊敏志（1992―），男，碩士研究生，研究方向為水產養(yǎng)殖。E-mail: 2693140787@ qq.com

通信作者：李長玲, 女, 教授, 研究方向為水域生態(tài)學。E-mail:ybc1901@126.com

楊敏志，李長玲，黃翔鵠，等. 氮濃度、溫度和照度對波吉卵囊藻繁殖模式的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（5）：44-49.

（責任編輯：劉慶穎）