龔靜 張清華

[摘要] 目的 探討CBLN1基因與肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，闡明肝癌患者中CBLN1基因表達(dá)差異對(duì)DCC通路的調(diào)控作用。方法 采用RT-PCR 法檢測2017年1月～2018年12月于本院住院的 41對(duì)肝癌患者術(shù)后肝癌和癌旁組織中CBLN1基因的表達(dá)水平;通過Western-blot方法檢測CBLN1蛋白在肝癌中的表達(dá)情況。采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)沉默肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞株中 CBLN1 基因的表達(dá)，并觀察對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞增殖、遷移的影響;采用在Huh-7細(xì)胞株中是否過表達(dá)CBLN1質(zhì)粒方法，觀察對(duì)Huh-7細(xì)胞DCC表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移的影響。 結(jié)果 在41對(duì)收集的肝癌和癌旁組織中，30對(duì)肝癌樣本中CBLN1表達(dá)顯著增高（P<0.05）。在轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3質(zhì)粒的細(xì)胞中CBLN1表達(dá)被沉默[2]，使得PLC/PRF/5細(xì)胞的遷移受到了抑制;在CBLN1過表達(dá)的Huh-7細(xì)胞株中DCC表達(dá)顯著降低（P<0.05），而轉(zhuǎn)染CBLN1質(zhì)粒48 h后Huh-7細(xì)胞株的遷移能力明顯提升。 結(jié)論 抑制CBLN1基因表達(dá)肝癌細(xì)胞的生長受到抑制，過表達(dá)CBLN1基因可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移，抑制了肝癌細(xì)胞DCC的表達(dá)，提示CBLN1與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，其調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移與DCC信號(hào)通路相關(guān)，并為提供潛在的臨床診斷與藥物治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 肝癌 ;CBLN1基因;信號(hào)通路;功能

[中圖分類號(hào)] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）20-0015-04

Study on the expression of CBLN1 gene in hepatocellular carcinoma and its regulatory function on DCC pathway

GONG Jing? ?ZHANG Qinghua

Department of Clinical Laboratory， Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Western and Chinese Medicine， Nanchang? ?330003， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between CBLN1 gene and metastasis of liver cancer， and to elucidate the regulatory effect of CBLN1 gene expression on DCC pathway in the patients with liver cancer. Methods The expression levels of CBLN1 gene in postoperative liver cancer tissues and paracancerous tissues of 41 pairs of patients with liver cancer who were admitted to our hospital from January 2018 to February 2018 were detected by RT-PCR method; the expression of CBLN1 protein in liver cancer was detected by Western-blot method. The expression of CBLN1 gene in liver cancer PLC/PRF/5 cell line was silenced by small interfering RNA （siRNA） technique， and the effect on the proliferation and migration of PLC/PRF/5 cells was observed; the method of whether the CBLN1 plasmid was overexpressed in the Huh-7 cell line was used， and the effects of DCC expression， cell proliferation and migration on Huh-7 cells were observed. Results Of the 41 pairs of collected liver cancer tissues and paracancerous tissues，CBLN1 expression was significantly increased in 30 pairs of liver cancer samples（P<0.05）. CBLN1 expression was silenced in cells transfected with siRNA-1， siRNA-2， and siRNA-3 plasmids， resulting in inhibition of PLC/PRF/5 cell migration; DCC expression was significantly decreased in CBLN1 overexpressing Huh-7 cell line （P<0.05）， and the migration ability of Huh-7 cell line was significantly increased after transfection of CBLN1 plasmid for 48 h. Conclusion The growth of liver cancer cells was inhibited when inhibiting the expression of CBLN1 gene. Overexpression of CBLN1 gene may have promoted the migration of liver cancer cells and inhibit the expression of DCC in liver cancer cells， suggesting that CBLN1 is involved in liver cancer metastasis. Its regulation of liver cancer metastasis is associated with DCC signaling pathway and serves as a new target for potential clinical diagnosis and drug therapy.

[Key words] Liver cancer; CBLN1 gene; Signal pathway; Function

肝細(xì)胞癌（Human hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，肝癌在男性及女性中發(fā)病率分別位列第五位及第七位，在癌癥死亡率中則分別列第二位及第六位，其中有約半數(shù)患者來自中國[1]。因此深入研究肝癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)我國居民健康具有重大意義。本課題組前期的肝癌研究工作中，通過cDNA基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)肝癌中CBLN1基因表達(dá)明顯上調(diào)，但目前CBLN1在肝癌及其他腫瘤中尚未見報(bào)道，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CBLN1與DCC通路可能關(guān)聯(lián)，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與遷移，推測CBLN1可能調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)DCC通路，促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。

在本實(shí)驗(yàn)前期的肝癌研究工作中，通過cDNA基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)肝癌中CBLN1基因表達(dá)明顯上調(diào)。與DCC通路相關(guān)聯(lián)，與肝癌細(xì)胞株的增殖和遷移相關(guān)，推測CBLN1可能調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)通路DCC通路，促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，具體機(jī)制尚不明確。本研究觀察CBLN1基因在肝癌中的表達(dá)情況;研究CBLN1對(duì)DCC信號(hào)通路相關(guān)蛋白及其下游蛋白的作用，對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并初步闡明其調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 樣本采集及細(xì)胞分組

檢測CBLN1、DCC基因在肝癌及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，本研究中所用41對(duì)肝癌及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織來自本院2017年1月～2018年12月入院的肝癌患者，且均是HBV陽性的原發(fā)性肝細(xì)胞癌手術(shù)患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合全國肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議制定的《原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)》中肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn);②經(jīng)病理學(xué)確診為肝癌;③術(shù)前患者均未接受過放療、化療或生物治療等干預(yù)措施;④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他惡性腫瘤者;②嚴(yán)重的肝腎功能異常者;③嚴(yán)重的認(rèn)知功能異常者;④嚴(yán)重的代謝系統(tǒng)疾病者[2]。手術(shù)樣本的留取均征得患者認(rèn)可。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及離病灶至少5 cm以上的周圍正常組織，放入液氮中保存;作為確診的最終病理診斷依據(jù)。取Huh-7細(xì)胞分為兩組：GFP組：轉(zhuǎn)染GFP空載質(zhì)粒的細(xì)胞株;CBLN1組：轉(zhuǎn)染CBLN1質(zhì)粒的細(xì)胞株。取PLC/PRF/5細(xì)胞分為四組：siRNA-NC組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組，分別為轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)質(zhì)粒的PLC/PRF/5細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞密度生長至70%，按lipofectamin 2000說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用250 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋100 pmol相應(yīng)質(zhì)粒（加入細(xì)胞中的終濃度50 nM），混勻，室溫孵育5 min;用250 μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μL lipofectamin 2000，混勻并室溫孵育5 min;將以上兩者混勻，室溫孵育20 min加入至細(xì)胞培養(yǎng)孔中;37℃，5% CO2培養(yǎng)6～8 h后，換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 RT-PCR檢測

采用trizol分別抽提獲得的肝癌和癌旁組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定其濃度后，各取2 μg總RNA，設(shè)計(jì)β-ACTIN、CBLN1、DCC引物。將RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和無RNA酶水置于冰上溶解備用。逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL，參照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer 說明書進(jìn)行，設(shè)定反應(yīng)條件為：42℃，30～50 min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃ 5 s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）。取反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR，參照SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR操作。反應(yīng)體系50 μL：SYBRR Premix Ex TaqTM II（2×）25 μL，PCR上游引物2 μL，PCR下游引物2 μL，ROX Reference Dye（50×）1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O16 μL。在ABI系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次后72℃延伸1 min。以β-ACTIN為內(nèi)參。2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系，公式如下：ΔΔCT=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。Ct為反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，此時(shí)擴(kuò)增是呈對(duì)數(shù)期增長，此處實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 組織芯片（tissue microarray，TMA）

選取獲得的肝臟組織，采用石蠟包埋的組織微陣列。運(yùn)用熒光原位雜交（FISH技術(shù);使用組織芯片點(diǎn)樣儀將標(biāo)記好的組織按設(shè)計(jì)排列在空白蠟塊上，利用打孔機(jī)在已經(jīng)標(biāo)記好的靶位點(diǎn)上進(jìn)行打孔，將組織芯轉(zhuǎn)入蠟塊孔中，重復(fù)操作可轉(zhuǎn)入上千個(gè)樣品組織芯。使用切片機(jī)對(duì)陣列蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片即獲得組織芯片。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，檢測后標(biāo)記出待研究的區(qū)域進(jìn)行拍片分析。

1.4 Western-blot檢測

采用總蛋白提取液RIPA試劑盒提取總蛋白。用預(yù)冷的PBS洗滌轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞3遍。每個(gè)細(xì)胞瓶中加入適量的蛋白裂解液，收集于EP管中，冰上靜置裂解30 min。于4℃，13500 rpm離高速冷凍離心機(jī)中心30 min，收集上清液，置于冰盒上，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。然后使用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制10%分離膠和5%積層膠，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離轉(zhuǎn)至NC膜上，5% BSA室溫下封閉1 h。滴加稀釋的鼠抗人β-ACTIN和稀釋的兔抗人CBLN1，以上均來自Abcam。4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，孵育與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗用5%脫脂牛奶稀釋二抗，孵育1 h后再次用TBST洗膜3次，加入顯影劑并通過bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)顯影，使用IPP7.0軟件進(jìn)行定量分析。CBLN1條帶與內(nèi)參β-ACTIN灰度值的比值代表各自的含量。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

取Transwell小室放入24孔板內(nèi)，用Matrigel 1：8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，室溫下風(fēng)干;各組細(xì)胞常規(guī)消化后，用PBS漂洗2次后DMEM培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液200 μL加入已鋪Matrigel膠的Transwell小室的上室，將600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下室;常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內(nèi)面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結(jié)晶紫溶液（用甲醇配制）染色15 min，PBS洗3遍，用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野（200×）進(jìn)行拍照。拍照后用33%冰醋酸300 μL溶解膜上的結(jié)晶紫，酶標(biāo)儀測定D573。穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]，數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CBLN1基因在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

在30對(duì)肝癌和癌旁樣本中通過RT-PCR驗(yàn)證CBLN1基因表達(dá)增高的比例為83.3%（封三圖1A）。并進(jìn)行肝癌組織芯片檢測，其中組織芯片檢測包括41對(duì)肝癌和癌旁組織標(biāo)本。結(jié)果提示，在41對(duì)肝癌和癌旁組織中，30對(duì)肝癌樣本中CBLN1表達(dá)顯著增高，比例為73.2%。表達(dá)差異顯著的肝癌組織樣本26N/C的高倍鏡視野圖如圖所示（封三圖1B）。

通過CBLN1的過表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CBLN1過表達(dá)的Huh-7細(xì)胞株中DCC表達(dá)顯著降低，說明這兩個(gè)基因表達(dá)存在相關(guān)性（封三圖2），CBLN1在肝癌發(fā)生發(fā)展中與DCC通路可能存在密切聯(lián)系。

2.2 CBLN1肝癌細(xì)胞的增殖與遷移的相關(guān)性

研究利用CBLN1的siRNA轉(zhuǎn)染PLC/PRF/5細(xì)胞株。RT-PCR證實(shí)，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3位點(diǎn)的干擾效果較滿意（封三圖3B），軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察到瞬間轉(zhuǎn)染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3抑制了PLC/PRF/5細(xì)胞的遷移（封三圖3A）。當(dāng)干擾CBLN1時(shí)肝癌細(xì)胞增殖和貼壁生長均減少，提示CBLN1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞貼壁非依賴性的生長。

當(dāng)過表達(dá)CBLN1的質(zhì)粒以及空載對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Huh-7細(xì)胞株，經(jīng)Western驗(yàn)證（封三圖3C）發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)入CBLN1質(zhì)粒的細(xì)胞沒有表達(dá)對(duì)應(yīng)基因;轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的測定，結(jié)果顯示過表達(dá)CBLN1能夠增加Huh-7細(xì)胞株的遷移能力（封三圖3D）。

3 討論

CBLN1（cerebellin 1 precursor）是定位于16q12.1，能夠編碼小腦肽前體蛋白（cerebellin 1 precursor protein，precerebellin，CBLN1）。1991年，Urade Y等首次報(bào)道小腦顆粒細(xì)胞分泌產(chǎn)生的precerebellin經(jīng)蛋白水解生成小腦肽（cerebellin）維持小腦功能[3]。CBLN1是補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子（C1q/TNF）超家族成員之一[4，5]。CBLN1自小腦顆粒細(xì)胞分泌釋放后，形成多聚體，到達(dá)平行纖維-浦肯野細(xì)胞突觸后位點(diǎn)，特異地結(jié)合于突觸后膜的特異受體，促進(jìn)突觸發(fā)生。小鼠小腦浦肯野細(xì)胞上的谷氨酸鹽delta2孤兒受體（orphan delta2 glutamate receptors，GluRdelta2）通過CBLN1鏈接突觸前的軸突蛋白（neurexins，NRXNs），形成GluRdelta2-Cbln1-NRXNs三聯(lián)體，是突觸形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[6-8];是體內(nèi)促進(jìn)平行纖維-浦肯野細(xì)胞突觸形成的強(qiáng)誘導(dǎo)劑。在突觸形成過程中，平行纖維延伸出的突起能夠促進(jìn)突觸成熟，利用CBLN1能夠打開和關(guān)閉平行纖維與浦肯野細(xì)胞之間的連接[9]。CBLN1蛋白在小腦、丘腦、紋狀體等多個(gè)腦區(qū)域中作為粘附分子促進(jìn)突觸形成，維持突觸功能。CBLN1蛋白本來就是一種新的神經(jīng)傳遞因子，對(duì)于癌細(xì)胞該基因的表達(dá)增加，可能促進(jìn)相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移。

抑癌基因DCC（deleted in colorectal carcinoma）1990年由Fearon ER等[10]在結(jié)直腸癌中首次報(bào)道。隨后研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。2012年發(fā)表于《Nature》的最新文獻(xiàn)報(bào)道DCC抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[11]。DCC表達(dá)蛋白的胞外配體是神經(jīng)生長因子Netrin-1，胞內(nèi)區(qū)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)包括Caspases切割位點(diǎn)。作為依賴性受體，缺乏軸突導(dǎo)向配體Netrin-1時(shí)，DCC-Caspase活化復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]，Netrin-1存在時(shí)，能夠通過泛素-蛋白酶體途徑降解細(xì)胞表面的DCC，抑制細(xì)胞凋亡[13]，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。既往文獻(xiàn)報(bào)道，DCC雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）是肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的早期改變之一[14]。DCC在肝癌組織中呈現(xiàn)顯著高甲基化改變，與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[15]。肝癌細(xì)胞的增殖遷移等可能與Netrin1-DCC信號(hào)通路有密切聯(lián)系。

在前期的研究中觀察到CBLN1基因在肝癌中表達(dá)顯著增高，與DCC通路相關(guān)聯(lián)，與肝癌細(xì)胞株的增殖與遷移相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)CBLN1可能調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)DCC信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。通過cDNA基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)肝癌中CBLN1基因表達(dá)明顯上調(diào)。而且在肝癌和癌旁樣本的CBLN1基因表達(dá)相比其增高達(dá)83.3%，肝癌組織芯片檢測提示肝癌標(biāo)本中CBLN1表達(dá)顯著增高比例為73.2%。提示CBLN1與肝癌的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)。通過過表達(dá)CBLN1的質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)CBLN1過表達(dá)的Huh-7細(xì)胞株中DCC表達(dá)顯著降低，二者基因表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，提示CBLN1在肝癌中與DCC通路可能相關(guān)。另外，針對(duì)CBLN1的siRNA干擾PLC/PRF/5細(xì)胞株的內(nèi)源性表達(dá)，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察到瞬間轉(zhuǎn)染siRNA抑制PLC/PRF/5細(xì)胞的增殖。提示干擾CBLN1過表達(dá)CBLN1基因可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移表達(dá)會(huì)抑制肝癌細(xì)胞增殖，減少肝癌細(xì)胞貼壁非依賴性的生長。實(shí)體瘤細(xì)胞都是以貼壁方式進(jìn)行生長，當(dāng)癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，則以循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）的方式通過血液循環(huán)運(yùn)行，表現(xiàn)出貼壁非依賴的存活特性[16]。本研究在軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察到CBLN1促進(jìn)肝癌細(xì)胞貼壁非依賴性的生長，提示與肝癌細(xì)胞的遷移相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證CBLN1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響，用CBLN1的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞遷移能力測定顯示過表達(dá)CBLN1能夠增加Huh-7細(xì)胞的遷移能力。

本研究以CBLN1基因作為主要研究對(duì)象，檢測肝癌患者中CBLN1基因表達(dá)差異、對(duì)DCC通路的調(diào)控作用、CBLN1基因異常表達(dá)的機(jī)制及功能的變化，明確CBLN1與肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，初步闡明其調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)DCC信號(hào)通路的機(jī)制，為肝癌的研究提供新的思路，并提供潛在的臨床診斷與藥物治療的新靶點(diǎn)。但是，調(diào)控DCC信號(hào)通路的上下游具體情況，還有待進(jìn)一步深入研究。

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