梁婕　劉愛(ài)華

【摘要】 目的：構(gòu)建EV71基因的原核表達(dá)載體，并在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)與純化。方法：根據(jù)已知EV71全長(zhǎng)核酸序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法擴(kuò)增VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)基因片段，對(duì)目的基因進(jìn)行酶切并克隆至pET-14b原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá);所獲得的不可溶性蛋白經(jīng)尿素裂解超聲，親和層析純化，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果：測(cè)序證實(shí)原核重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;可表達(dá)高純度的四個(gè)蛋白，且蛋白大小與預(yù)計(jì)值相符。結(jié)論：成功構(gòu)建了手足口病主要致病原腸道病毒71型（EV71）的四個(gè)衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的原核表達(dá)載體，并純化得到高純度的四個(gè)蛋白，為進(jìn)一步研究手足口病致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 EV71; 基因克隆; 蛋白表達(dá)

Gene Clone and Expression of Capsid Proteins of EV71-the Main Pathogen of HFMD/LIANG Jie，LIU Aihua.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：00-008

【Abstract】 Objective：To construct a prokaryotic expression vector of EV71 gene and have gene expression and purification in prokaryotic cells.Method：According to the full-length gene sequence of EV71 reported in GenBank，the primers were designed by using DNA Star software，based on which VP1-VP4 genes were amplified by PCR and inserted into prokaryotic expression vector pET-14b respectively.The constructed recombinant plasmid pET-14b-VPs were transformed to E.coli of BL21 strain for recombinant protein expression under induction of IPTG.The insoluble proteins were lysed in urea by supersonic，and the supernatant was collected for the purification with Ni2+-affinity chromatography，followed by SDS-PAGE.Result：Restrict enzyme digestion analysis and DNA sequencing proved that recombinant plasmids pET-14b-VP1-4 were constructed correctly.We found that the VP recombinant proteins were induced，but mainly existed in the inclusion body.By means of denaturation and renaturation，we obtained VP1-VP4 protein with high purity.Conclusion：Prokaryotic expression plasmids for VP1-VP4 were successfully constructed and the recombinant proteins were induced in E.coli，VP1-VP4 protein were obtained with high purity，which provides a solid foundation to study the mechanism of pathogenesis of HFMD.

【Key words】 EV71; Gene clone; Protein expression

First-authors address：Guangdong Second Provincial Central Hospital，Guangzhou 510317，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.002

自1969年首次從美國(guó)加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便中分離到腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）以來(lái)，全世界已有十多次爆發(fā)和流行[1-3]，特別是20世紀(jì)90年代以來(lái)，在亞太地區(qū)流行日益猖獗。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種（型）?？滤_奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）較常見(jiàn)的病原體[4-5]，柯薩奇A組16型（Coxsakie A16，CoxA16）和EV71最為常見(jiàn)，其中EV71病毒是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和死亡病例的主要病原體[6]。

EV71屬于小RNA病毒科（Picornaradae）腸道病毒屬（Enterovirus）的成員[7]。EV71的病毒顆粒為二十面體立體對(duì)稱(chēng)的球形結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜和突起，直徑在24～30 nm，核酸為單股正鏈RNA。病毒粒子的衣殼組成非常復(fù)雜，首先由VP1、VP2、VP3和VP4四種外殼蛋白構(gòu)成原聚體（Protomer），再由5個(gè)原聚體拼裝成具有五聚體樣結(jié)構(gòu)的亞單位。四種衣殼蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接以外，其他三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露在病毒顆粒的表面，因而抗原決定簇基本上位于VP1～VP3上[8]（圖1）。

EV71病毒可引起神經(jīng)系統(tǒng)以及呼吸系統(tǒng)損傷，其中肺水腫是該病最嚴(yán)重的并發(fā)癥以及主要死因，致死致殘率較高，已嚴(yán)重威脅兒童的身體健康和生命安全。但目前對(duì)EV71具體致病機(jī)制仍不清楚，尤其是具體每個(gè)衣殼蛋白的功能以及作用于細(xì)胞的信號(hào)通路，再者臨床上尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的疫苗來(lái)預(yù)防EV71的感染。鑒于此，本文對(duì)腸道病毒EV71的衣殼蛋白基因進(jìn)行體外克隆并在大腸桿菌中表達(dá)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌種 pET-14b、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）均由本室保存，EV71病毒全長(zhǎng)模板由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所宋宏彬教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑 引物由華大基因有限公司合成。限制性?xún)?nèi)切酶（Kpn I、Not I）購(gòu)自TaKaRa公司;高保真DNA聚合酶KOD plus neo、Ligation High連接酶是Toyobo公司產(chǎn)品，100 bp和1 kD DNA ladder購(gòu)自Axygen公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;QIAprep Spin Miniprep Kit和Ni2+-NTA親和樹(shù)脂購(gòu)自Qiagen公司;苯甲磺酰胺（phenylmenthylsulfonyl fluoride，PMSF）和蛋白酶抑制劑混合物（cocktail of proteases inhibitor）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;尿素、氨芐青霉素及其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 pET-14b-VP1/VP2/VP3/VP4重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PCR技術(shù)以EV71全長(zhǎng)序列為模板，使用特異性引物（表1）分別擴(kuò)增VP1～VP4編碼序列。用高保真DNA聚合酶KOD plus neo進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為98 ℃，10 s;58 ℃，30 s;68 ℃，1 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增片段預(yù)期大小分別為914 bp（VP1）、785 bp（VP2）、749 bp（VP3）、227 bp（VP4）。將PCR產(chǎn)物和載體pET-14b-MCS分別用Kpn I和Not I雙酶切并電泳切膠回收后，用Ligation High連接酶連接，將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌株DH5。挑取單菌落接種于Amp+的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振搖過(guò)夜。取5 mL菌液用AxyPrep質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒后，使用上述引物進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定。PCR鑒定產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠圖像分析儀上成像。重組載體最終經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 His-VP1/VP2/VP3/VP4融合蛋白的原核表達(dá)及純化 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒（圖2）轉(zhuǎn)化大腸桿菌株BL21（DE3）。挑取單菌落，置于2 mL LB培養(yǎng)基（Amp+）中，37 ℃振搖培養(yǎng)至D600約為0.6 h，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖3 h。利用12% SDS-PAGE來(lái)鑒定表達(dá)融合蛋白的菌落。

對(duì)高效表達(dá)帶His標(biāo)簽的VP1、VP2、VP3、VP4融合蛋白的細(xì)菌，擴(kuò)增到200 mL體積并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。8 000 g，4 ℃離心5 min，收集細(xì)菌并重懸于8 mL結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCL，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH值8.0）在冰上超聲裂解細(xì)菌，14 000 g，4 ℃離心30 min，此時(shí)收集部分上清及沉淀行12% SDS-PAGE鑒定可知，His-VP1～VP4蛋白都主要以包涵體的形式存在于沉淀中。因此，將各自的沉淀收集，使用變性復(fù)性的方法純化：繼續(xù)使用結(jié)合緩沖液把沉淀重懸后14 000 g，4 ℃離心30 min，去上清，往沉淀中加入含8 mol/L尿素、5 mmol/L DTT的裂解緩沖液，室溫超聲使細(xì)菌充分裂解，再將超聲后液體室溫孵育過(guò)夜，直至溶液變澄清后，20 ℃，14 000 g，

30 min離心，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中。20 ℃，14 000 g，15 min再次離心，獲取清澈的上清液。將上清轉(zhuǎn)入裝有Ni2+-NTA親合樹(shù)脂的層析柱中，并讓其自然流出，然后用5 mL含8 mmol/L尿素的結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合蛋白，再用5 mL（1 mL/次）含8 mmol/L尿素的沖洗緩沖液（20 mmol/L Tris-HCL，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，8 mmol/L尿素，pH值8.0）洗滌非特異結(jié)合蛋白，最后用含8 mmol/L尿素的0.5 mL洗脫緩沖液（20 mmol/L?Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，400 mmol/L咪唑，8 mmol/L尿素，pH值8.0）洗脫重組蛋白，梯度透析并過(guò)濾除菌后，用12% SDS-PAGE鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pET-14b-VP1～VP4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用PCR技術(shù)以擴(kuò)增得到了相應(yīng)大小的VP1～VP4編碼序列（圖3）。將挑取的單克隆提取質(zhì)粒，并行酶切鑒定，得到酶切陽(yáng)性克隆（圖4）。再把酶切陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序，結(jié)果（用T7 promoter primer測(cè)通）證實(shí)插入到pET14b-MCS載體中的目的片段是正確的（圖5）。

2.2 His-VP1/VP2/VP3/VP4融合蛋白的原核表達(dá)及純化 將上述構(gòu)建成功的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌株BL21（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)四個(gè)衣殼蛋白均為不可溶的包涵體蛋白，使用尿素變性復(fù)性的方法純化，獲得高純度的His-VP1～VP4四個(gè)蛋白，且蛋白表觀(guān)質(zhì)量與理論預(yù)期相符，但VP1～VP3表達(dá)量不高（圖6）。

3 討論

自1997年來(lái)，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì)[9]。1998年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)EV71感染大爆發(fā)[10]。近幾年來(lái)，我國(guó)廣東、福建、上海、重慶等地區(qū)均有局部流行的報(bào)道[11-14]。手足口病流行對(duì)我國(guó)兒童健康造成嚴(yán)重危害，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)損害，引起高度重視。具體EV71的四個(gè)衣殼蛋白分別有什么功能，介導(dǎo)哪條信號(hào)通路，引起機(jī)體的哪些細(xì)胞因子的激活，哪一個(gè)蛋白起決定作用，仍沒(méi)有系統(tǒng)地介紹，所以很有必要對(duì)這四個(gè)蛋白基因進(jìn)行分子克隆和蛋白表達(dá)純化，為后續(xù)的研究打好基礎(chǔ)。