江斌?畢敏?馬琪林?童綏君

【摘要】 目的：探討TREM2基因與中國福建阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）患者的關聯(lián)性。方法：納入中國福建地區(qū)106例AD患者（AD組）和120例健康對照者（健康對照組），提取其外周血白細胞DNA和RNA，運用Sanger測序方法檢測TREM2基因R47H變異，同時利用實時熒光定量PCR方法檢測mRNA表達水平，分析TREM2基因與AD的相關性。結(jié)果：AD組與健康對照組TREM2基因R47H變異比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），同時兩組人群TREM2基因mRNA水平相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：TREM2基因可能與中國福建AD患者無明顯相關性。

【關鍵詞】 阿爾茨海默病; TREM2基因; R47H變異; 中國福建

Associations between TREM2 Gene and Alzheimer Disease Patients in Fujian Province of China/JIANG Bin，BI Min，MA Qilin，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（24）：-157

【Abstract】 Objective：To clarify the associations between the TREM2 gene and Alzheimer disease（AD）patients in Fujian province of China.Method：We investigated 106 AD patients（AD group）and 120 healthy controls（healthy control group）in Fujian province.DNA and RNA were extracted from peripheral blood leukocytes，the R47H variant in TREM2 gene was detected by Sanger sequencing.Moreover，the level of mRNA was determined by quantitative Real-time PCR，and the correlation between TREM2 gene and AD was analyzed.Result：The genotypic and allelic distributions of R47H variant were not statistically significant different between AD group and the healthy control group（P>0.05）.Meanwhile，the level of mRNA of TREM2 gene was not statistically significant different between two groups（P>0.05）.Conclusion：There is no association between TREM2 gene and AD patients in Fujian province of China.

【Key words】 Alzheimer disease; TREM2 gene; R47H variant; Fujian province of China

First-authors address：First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.24.041

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以進行性不可逆的認知功能障礙和行為損害為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，是癡呆最常見的類型，隨著疾病的進展，患者的社會能力和工作能力逐漸喪失。目前全世界約有AD患者3 560萬人，約占全球總?cè)藬?shù)的1%，預計患病人數(shù)至2050年將增加至1.154億人[1]，同時全世界每年花費在AD患者上的經(jīng)濟費用高達1 830億美元，可見AD對全人類是一個沉重的負擔。根據(jù)有無家族史，AD分為家族性AD（familial AD，F(xiàn)AD）和散發(fā)性AD（sporadic AD，SAD），其中95%AD患者為SAD，他們的發(fā)病年齡多大于65歲。SAD的發(fā)病機制尚不明確，目前主要認為與Aβ在腦中聚集形成神經(jīng)炎性斑和過度磷酸化的Tau蛋白折疊形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)相關[2]，這些物質(zhì)的形成導致大腦皮層、杏仁核、海馬和基底前腦等多個區(qū)域的中樞神經(jīng)元丟失。

既往研究提示基因在AD的發(fā)病和疾病進展中起到重要的作用，基因的變異如基因多態(tài)性可以增加AD患病和疾病進展的風險。根據(jù)大規(guī)模全基因組關聯(lián)分析，APOE、BIN1、ABCA7、GLU、CD2AP、TREM2等基因證實與SAD發(fā)病有關[3-6]。這些基因主要通過影響免疫系統(tǒng)、脂代謝和Aβ代謝參與到AD的發(fā)病機制中。其中髓樣細胞觸發(fā)性受體-2（triggering receptor experssed on myeloid cells 2，TREM2）基因是近幾年新發(fā)現(xiàn)的AD易感基因，其編碼區(qū)內(nèi)R47H變異（rs75932628-T）可使SAD的發(fā)病風險增加3倍左右[7]。在隨后多項高加索AD患者和中國漢族AD患者大樣本研究中也證實TREM2基因R47H變異可以顯著增加AD的風險[8-10]。

深入研究TREM2基因可以更好地了解AD的發(fā)病機制，為藥物的治療提供新的靶點，同時可以結(jié)合腦脊液、血清生物標記物和影像表現(xiàn)，觀察其與AD進展的相關性。本研究擬驗證TREM2基因與中國福建SAD患者是否具有相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究入組患者為2016年8月-2018年10月在廈門大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診的SAD患者（AD組），共計106例，SAD患者臨床評估均由兩名以上高年資神經(jīng)內(nèi)科?？漆t(yī)師進行。AD臨床診斷參照《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊第四版》和美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關疾病協(xié)會標準。納入標準：符合癡呆診斷標準，同時滿足隱襲起病，癥狀逐漸進展;認知損害檢查發(fā)現(xiàn)遺忘、語言障礙、執(zhí)行功能障礙、視空間障礙。排除標準：路易小體癡呆、行為變異性額顳葉癡呆、血管性認知障礙、非流利性原發(fā)性進行性失語和其他可以導致認知障礙的神經(jīng)科并發(fā)癥。同時筆者在同個地區(qū)社區(qū)中納入120例健康對照者（健康對照組）。每位患者和健康對照者均進行神經(jīng)系統(tǒng)檢查、神經(jīng)影像檢查和簡易智力狀態(tài)檢查量表（MMSE）評估。本研究通過廈門大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，參與者均由本人或代理人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血白細胞基因組DNA提取 取受試者外周靜脈血2 mL加入3倍體積1×紅細胞裂解液靜置15 min，3 000 r/min室溫條件下離心3 min，去除上清。加入2 mL 1×紅細胞裂解液重懸細胞，靜置10 min后5 000 r/min在室溫條件下離心3 min。去除上清后，加入200 ?L 1×PBS液重懸細胞，同時緩慢加入20 ?L蛋白酶和200 ?L AL液，水浴鍋內(nèi)恒溫56 ℃孵育20 min。再加入200 ?L無水乙醇，混勻后將EP管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至QIAamp Spin Colum柱內(nèi)，室溫條件下9 000 r/min離心3 min。加入500 ?L AW1液體后，室溫條件下9 000 r/min離心1 min后加入500 ?L AW2液體繼續(xù)靜置，在室溫條件下12 000 r/min離心5 min。打開EP管蓋子靜置15 min使EP管內(nèi)的乙醇充分揮發(fā)。加入150?L預熱的AE液室溫條件下靜置15 min，9 000 r/min離心3 min。EP管內(nèi)收集到的液體即為外周血白細胞基因組DNA。通過紫外分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度，保證其OD260/280比值在1.8～2.0，做好標記后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 外周血白細胞RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

1.2.2.1 外周血白細胞RNA提取 在外周血白細胞內(nèi)加入1 mL RNAiso Plus，轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)。加入200 μL氯仿，上下顛倒使液體充分混勻，在冰上靜置15 min后，4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min。吸取液體上層水相至新的EP管內(nèi)，加入500 ?L異丙醇混勻充分，在冰上靜置15 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，在EP管底部可見白色沉淀。去除上清，加入1.5 mL 75%乙醇，上下顛倒清洗白色沉淀。4 ℃條件下7 500 r/min離心5 min，去除上清。室溫干燥30 min，加入20 ?L DEPC水充分溶解白色沉淀，同時測量RNA濃度，標記后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄 使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為：2.0 ?L 5×PrimeScript RT Master Mix試劑+500 ng RNA+ddH2O。逆轉(zhuǎn)錄PCR反應條件為37 ℃條件下反應15 min，85 ℃條件下反應5 s，4 ℃條件下反應10 min，反應產(chǎn)物保存于-20 ℃條件下。

1.2.3 TREM2基因R47H變異檢測 本研究采用Sanger測序方法檢測TREM2基因R47H變異，引物由上海生工公司設計合成。實驗步驟包括PCR反應、PCR產(chǎn)物純化、測序反應和酒精純化，具體操作步驟參考文獻[11]。利用Chromas軟件對測序結(jié)果進行判讀，結(jié)果與Ensembel數(shù)據(jù)庫中人基因標準序列進行比對。

1.2.4 實時熒光定量PCR 通過Primer Bank設計針對TREM2基因和GAPDH基因特異性引物，建立實時熒光定量PCR反應體系，具體為10 ?mol/?L

濃度正反向引物各0.4 ?L，cDNA模板250 ng，ROX溶液0.2 ?L，SYBR Premix Ex Taq溶液5 ?L，ddH2O 3 ?L。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃條件下變性30 s，40個擴增循環(huán)（95 ℃條件下反應5 s，62 ℃條件下反應30 s）。建立溶解曲線，95 ℃條件下反應15 s，62 ℃條件下反應1 min。每個樣本3個復孔，重復3次實驗，每次實驗都設計1組空白對照。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0（SPSS Inc.，USA）統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 兩組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;AD組MMSE評分明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 TREM2基因R47H變異與AD的相關性 TREM2基因R47H變異在正常對照組的基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（字2=1.96，P>0.05），同時R47H變異在AD組的基因頻率分布也符合Hardy-Weinberg平衡（字2=1.65，P>0.05），見表2;兩組TREM2基因R47H變異的基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

2.3 兩組TREM2基因mRNA表達水平比較 通過實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：TREM2基因mRNA相對表達水平在AD組和健康對照組分別為（1.211±0.05）和（1.108±0.03），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=1.609，P>0.05）。

3 討論

自1907年報道了首例AD患者至今，有超過數(shù)以億計的患者深受其害，其主要表現(xiàn)為認知功能損害，同時常伴有精神行為的異常，最終導致機體功能喪失。有研究顯示，淀粉樣前體蛋白基因、早老素1基因和早老素2基因是最主要的早發(fā)型FAD的致病基因[12]。而晚發(fā)型SAD致病機制仍不清楚，目前考慮年齡增加、家族易感性、糖尿病、高血壓等因素均與其發(fā)病具有一定的相關性[13]。研究提示SAD發(fā)病可能與多個易感基因的共同作用有關，已知載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）ε4等位基因與晚發(fā)型AD發(fā)病確切相關，它可以明顯增加晚發(fā)型AD的發(fā)病風險[14]。而在2013年Jonsson等[7]學者通過基因組測定分析AD患者和健康人群的基因型差異，發(fā)現(xiàn)TREM2基因R47H變異明顯提高AD的發(fā)病風險3.4倍。同年另外一個研究通過外顯子測定發(fā)現(xiàn)TREM2基因R47H變異與AD也具有很強的關聯(lián)性[15]。隨后在德國、美國、挪威、荷蘭和加拿大等多個大規(guī)模AD患者研究中也肯定了TREM2基因R47H變異的致病性，而在中國漢族AD人群中，研究也得到了同樣的結(jié)果[16]。同時R47H變異也證實與其他神經(jīng)變性疾病相關，文獻[17-18]研究發(fā)現(xiàn)R47H變異與帕金森病發(fā)病相關。此外有研究發(fā)現(xiàn)R47H變異也是肌萎縮側(cè)索硬化和額顳葉癡呆發(fā)病的危險因素[19]。TREM2基因上除了R47H變異外，D87N變異也證實與AD具有關聯(lián)性。此外有報道提出Q33X、Y38C和T66M變異與額顳葉癡呆相關[20]。由此可見TREM2蛋白的功能異常是神經(jīng)退行性疾病的重要危險因素。

TREM2基因位于染色體6q21上，包含5個外顯子。它是由230個氨基酸組成的是一種跨膜糖蛋白，包括1個信號肽、1個IgG結(jié)構(gòu)域、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。TREM2蛋白與配體結(jié)合后向胞內(nèi)傳遞信號，目前認為TREM2蛋白主要由小膠質(zhì)細胞表達，其在AD發(fā)病機制中的作用尚不明確。TREM2具有免疫調(diào)節(jié)和吞噬作用，有研究提出減弱TREM2的活性可能通過增多炎癥反應從而引起大腦的損傷，它主要通過降低TNF-α和IL-6水平調(diào)節(jié)免疫[21-23]。同時有研究提出TREM2敲低后，小膠質(zhì)細胞吞噬凋亡神經(jīng)元的能力明顯下降[24]。

此外TREM2可能也通過參與Aβ的清除從而導致AD。由APP蛋白通過β分泌酶和γ分泌酶剪切降解生成的Aβ是AD的發(fā)病的重要危險因素，特別是Aβ42能通過聚集形成寡聚體和纖維模式，最終形成淀粉炎性斑塊。有研究提出過量表達TREM2的細胞中Aβ的清除與TREM2蛋白的表達水平具有正相關性。同時有研究提出TREM2基因變異可以抑制TREM2蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸至高爾基體，使其滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力升高，同時使其在細胞膜表達減少，影響其功能發(fā)揮，這被認為是TREM2變異主要的致病因素[25]。此外一系列臨床研究證明可溶性的TREM2（soluble TREM2，sTREM2）與AD的進程密切相關，可能參與調(diào)控AD的發(fā)生和進展。既往研究發(fā)現(xiàn)在人體腦脊液中sTREM2水平高于正常人群，考慮sTREM2與AD具有相關性[26]。但是有研究也發(fā)現(xiàn)sTREM2能夠有效誘導小膠質(zhì)細胞的增殖，增強其對淀粉樣斑塊的吞噬和降解功能，從而改善神經(jīng)突觸的可塑性，說明sTREM2在AD中可能具有重要的保護功能[27]。

本研究采用傳統(tǒng)的Sanger測序進行基因多態(tài)性分析，結(jié)果可靠準確，同時檢測AD患者中TREM2基因mRNA表達水平，研究結(jié)果提示在中國福建地區(qū)AD患者發(fā)病與TREM2基因R47H變異無相關性，同時AD患者外周血mRNA水平與正常健康人群相比無明顯差異（P>0.05）。筆者考慮這可能與本研究樣本量相對較小有關，同時僅檢測外周血未進行腦脊液檢測可能也會導致以上結(jié)果，有條件者應進一步擴大樣本量同時收集腦脊液再次進行檢測。本研究僅對R47H變異進行研究，考慮可以制作基因芯片同時對Q33X、Y38C、T66M等多個位于TREM2基因上的變異進行檢測，進一步探討TREM2基因與中國福建AD患者的關聯(lián)性。

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（收稿日期：2019-05-20） （本文編輯：程旭然）