袁小軍，王 森，郭紅艷，鐘秋平

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

華中五味子Schisandra sphenanthera為多年生木質(zhì)藤本植物，雌雄異株，花單性，異化授粉，分布于中國(guó)河南、陜西、江西、四川、貴州等地，生長(zhǎng)于海拔600～1 300 m 的濕潤(rùn)山坡或灌叢中[1-2]，屬國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生藥材，是重要的藥食同源植物，具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景。

開花以及花器官的發(fā)育是植物個(gè)體從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖發(fā)育轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段，對(duì)物種的繁衍具有重要的影響?；òl(fā)育外部形態(tài)與內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)之間存在一定的相關(guān)性，對(duì)花部結(jié)構(gòu)多樣性的認(rèn)識(shí)是探討被子植物系統(tǒng)發(fā)育的重要基礎(chǔ)[3]。劉忠等研究了五味子屬雄花形態(tài)建成的3 種類型，并討論了五味子屬植物的雄花在雄蕊形態(tài)上的原始性及其所反映的類群起源的古老性[4-5]。艾軍等研究了五味子花芽分化過(guò)程中內(nèi)源激素的變化[6]、花粉形態(tài)[7]、雌雄配子體[8]、授粉特性[9]的發(fā)育，對(duì)華中五味子雄花的生長(zhǎng)發(fā)育特性等研究至今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)華五味子雄花發(fā)育特征開展研究具有重要意義，可為研究五味子屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化、性別分化、遺傳育種和栽培管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

華中五味子的雄花采集于河南省欒川縣伏牛山地區(qū)，地理坐標(biāo)在111°11′～112°01′E、33°39′～34°11′N，海拔927 m，溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫12.1 ℃，年日照2 103 h，年均降水量862.8 mm；該地區(qū)有華北區(qū)系的植物、華中區(qū)系的植物和西南高寒區(qū)系的植物，土壤分為棕壤和褐土兩大類。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)特征

試驗(yàn)植株為收集于試驗(yàn)地的野生華中五味子種質(zhì)。2015年3—5月，在試驗(yàn)地中，隨機(jī)選取雄花30朵花蕾，用小卡片標(biāo)記，記錄Ⅲ（花蕾生長(zhǎng)期）、Ⅳ（花蕾膨大期）、Ⅴ（花冠展開期）、Ⅵ（盛開期）的生長(zhǎng)狀況?；ㄑ棵葎?dòng)期至花蕾萌動(dòng)期每天8:00、18:00 記錄，花瓣開始分離每天8:00—18:00 隔2 h記錄，花瓣開放后每天8:00—18:00 隔2 h 記錄。采用SMZ—168 體視顯微鏡觀察、測(cè)量其形態(tài)特征的變化并拍照記錄。

1.2.2 結(jié)構(gòu)特征

將經(jīng)FAA 固定好的不同發(fā)育時(shí)期的雄花用70%的乙醇溶液沖洗5 min 后，脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、復(fù)水、染色；花柄、花瓣采用番紅、固綠染色，雄蕊、雌蕊采用蘇木精染色；封片后在BA410 型生物光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.2.3 可溶性糖、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采集不同發(fā)育時(shí)期雌花，放進(jìn)液氮罐內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室，放進(jìn)-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆??？扇苄蕴呛坎捎幂焱宜嵋阴シy(cè)定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 雄花發(fā)育形態(tài)特征

研究華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期花部特征，研究結(jié)果見(jiàn)圖1。華中五味子雄花Ⅲ（花蕾生長(zhǎng)期）時(shí)期13～17 d，花瓣綠色，緊緊閉合（圖1，Ⅲ-1），雄蕊群綠色（圖1，Ⅲ-2），花絲綠色，花藥綠色偏白（圖1，Ⅲ-3），；華中五味子雄花Ⅳ時(shí)期8～ 12 d，（花蕾膨大期）花瓣綠色，邊沿泛紅，緊緊閉合（圖1，Ⅳ-1），雄蕊群綠白兩色相間（圖1，Ⅳ-2），花絲淡紅色，花藥米白色（圖1，Ⅳ-3）；華中五味子雄花Ⅴ（花冠展開期）時(shí)期2～5 d，內(nèi)側(cè)花瓣全部變紅，花蕾頂部露出紅色，花瓣逐漸展開（圖1，Ⅴ-1），雄蕊群紅白相間，紅色變深，白色變白（圖1，Ⅴ-2），花絲深紅色，花藥白色（圖1，Ⅴ-3）；華中五味子雄花Ⅵ時(shí)期4～7 d，（盛開期）花瓣全部變成紅色，花瓣彼此分離，花冠展開（圖1，Ⅵ-1），雄蕊群紅白相間，紅色更深，白色變淡（圖1，Ⅵ-2），花絲失水后變?yōu)榈S褐色，花藥開裂散粉后，可見(jiàn)明顯的白色花粉，花藥壁米黃色（圖1，Ⅵ-3）。

2.2 雄花發(fā)育結(jié)構(gòu)特征

圖1 華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期解剖特征Fig.1 The male flower features of Schisandra sphenanthera at different development stages by stereoscopic microscope

圖2 華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期花部石蠟切片F(xiàn)ig.2 The male flower features of Schisandra sphenanthera at different development stages by paraffin section

采用石蠟切片法對(duì)華中五味子雄花花部特征進(jìn)行研究，研究結(jié)果如圖2。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的華中五味子雄花花柄進(jìn)行橫切發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期花柄細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，由內(nèi)至外分別為維管柱、皮層和表皮，無(wú)次生結(jié)構(gòu)（圖2，Ⅲ-8、Ⅳ-8、Ⅴ-8、Ⅵ-8）。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的華中五味子雄花花瓣進(jìn)行縱切發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期花瓣細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)差異，由一層表皮細(xì)胞和大量薄壁細(xì)胞組成，隨著花的發(fā)育，薄壁細(xì)胞不斷分裂，花瓣增厚，花瓣上存在氣孔；Ⅲ（花蕾生長(zhǎng)期）時(shí)期花瓣細(xì)胞厚456.79 μm（圖2，Ⅲ-9），Ⅳ（花蕾膨大期）時(shí)期花瓣細(xì)胞厚650.70 μm（圖2，Ⅳ-9），Ⅴ（花冠展開期）時(shí)期花瓣細(xì)胞厚666.80 μm（圖2，Ⅴ-9），Ⅵ（盛開期）時(shí)期花瓣細(xì)胞厚685.12 μm（圖2，Ⅵ-9）。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的華中五味子雄花雄蕊進(jìn)行橫切發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期雄蕊細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異明顯，Ⅲ時(shí)期2 枚花藥已初步發(fā)育形成，藥隔與4 個(gè)藥囊已分化形成，藥隔由花粉囊壁和花粉室組成的，花粉母細(xì)胞之間、絨氈層之間以胞間連絲相連，絨氈層細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，花粉母細(xì)胞已開始積累胼胝質(zhì)，花粉成團(tuán)存在（圖2，Ⅲ-10）；Ⅳ時(shí)期2 枚花藥已形成，胼胝質(zhì)積累形成了胼胝質(zhì)壁，胞間連絲被阻斷，纖維素壁消失，絨氈層逐漸吸收，變?。▓D2，Ⅳ-10）；Ⅴ（花冠展開期）中層、絨氈層完全消失，花粉發(fā)育成熟，可明顯區(qū)分花粉囊和花粉囊壁（圖2，Ⅴ-10）；Ⅵ（盛開期）藥隔細(xì)胞形態(tài)不變，花粉囊破裂，花粉囊壁細(xì)胞失去生活力，花粉囊壁之間存在少量的花粉（圖2，Ⅵ-10）。

2.3 雄花可溶性糖含量

采用蒽酮-乙酸乙酯法對(duì)華中五味子雄花Ⅲ（花蕾生長(zhǎng)期）至Ⅵ（盛開期）花不同部位中可溶性糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。比較不同時(shí)期，雄花各部位中可溶性糖的含量發(fā)現(xiàn)，花柄、花瓣、雄蕊中可溶性糖含量均在Ⅵ（盛開期）時(shí)期達(dá)到最大值；Ⅳ時(shí)期花柄中可溶性糖含量高于Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ時(shí)期花柄中可溶性糖的含量，Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ時(shí)期花柄中可溶性糖含量無(wú)明顯差異。隨著發(fā)育時(shí)間的增加，花瓣中可溶性糖的含量逐漸增加，其中Ⅴ時(shí)期至Ⅵ時(shí)期增長(zhǎng)最為顯著，增長(zhǎng)了37.96 mg·g-1。隨著雄花發(fā)育逐漸成熟，花瓣中可溶性糖含量增加。隨著發(fā)育時(shí)間的增加，雄蕊中可溶性糖的含量逐漸增加，其中Ⅳ時(shí)期至Ⅴ時(shí)期增長(zhǎng)最為顯著，增長(zhǎng)了21.48 mg·g-1，這是雄蕊發(fā)育成熟的關(guān)鍵時(shí)期，花粉中開始貯藏糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；Ⅴ、Ⅵ兩時(shí)期雄蕊中可溶性糖的含量無(wú)明顯差異，因雄蕊在Ⅴ時(shí)期發(fā)育成熟，隨后逐漸開始散粉，因此Ⅴ時(shí)期后雄蕊中可溶性糖含量趨于穩(wěn)定。

表1 華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期花器官中可溶性糖含量Table1 The soluble sugar content in male flower of Schisandra sphenanthera at different development stages

比較同一時(shí)期花不同部位的可溶性糖含量發(fā)現(xiàn)，花柄、花瓣、雌蕊三者中，花瓣可溶性糖的含量最高，隨著花的逐漸成熟，可溶性糖含量迅速增加，這是花隨著生殖生長(zhǎng)的進(jìn)行，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量越來(lái)越大的一種表現(xiàn)。

對(duì)華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期花器中可溶性糖含量進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果見(jiàn)表2。發(fā)育時(shí)期、花部位均對(duì)其可溶性糖含量存在極顯著影響 （P＜0.01)。花柄可溶性糖含量與花瓣可溶性糖含量存在極顯著差異（P＜0.01)；花柄可溶性糖含量與雄蕊可溶性糖含量存在極顯著差異 （P＜0.01)；花瓣可溶性糖含量與雄蕊可溶性糖含量差異未達(dá)顯著水平。Ⅲ時(shí)期花器官可溶性糖含量與Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ時(shí)期可溶性糖含量差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01)；Ⅳ時(shí)期花器官可溶性糖含量與Ⅲ、Ⅵ時(shí)期可溶性糖含量差異達(dá)到極顯著水平 （P＜0.01)，與Ⅴ時(shí)期化器官可溶性糖含量差異未達(dá)顯著水平；Ⅴ時(shí)期化器官可溶性糖含量與Ⅲ時(shí)期可溶性糖含量差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01)，與Ⅳ、Ⅵ時(shí)期化器官可溶性糖含量差異未達(dá)顯著水平。

表2 華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期各器官中可溶性糖含量多重比較（表格中未標(biāo)出多重比較結(jié)果）?Table2 The multiple comparisons in male flower soluble sugar of Schisandra sphenanthera at different development stages

2.4 雄花可溶性蛋白含量

采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法對(duì)華中五味子雄花Ⅲ（花蕾生長(zhǎng)期）至Ⅵ（盛開期）花不同部位中可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。比較同一花部不同發(fā)育時(shí)期可溶性蛋白質(zhì)的含量發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)育時(shí)間的增加，Ⅲ時(shí)期至Ⅴ時(shí)期花柄中可溶性蛋白質(zhì)的含量逐漸降低，隨后升高；隨著發(fā)育時(shí)間的增加，Ⅲ時(shí)期至Ⅴ時(shí)期瓣中可溶性蛋白質(zhì)的含量逐漸降低，隨后升高；隨著發(fā)育時(shí)間的增加，Ⅲ時(shí)期至Ⅵ時(shí)期雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)的含量逐漸降低。比較不同花部同一發(fā)育時(shí)期的可溶性蛋白質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，Ⅲ時(shí)期雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)含量最高，分別高于花柄、花瓣1.24 mg·g-1、5.73 mg·g-1；Ⅳ時(shí)期花柄中可溶性蛋白質(zhì)含量最高，分別高于花瓣、雄蕊 4.78 mg·g-1、11.42 mg·g-1；Ⅴ時(shí)期雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)含量最高，分別高于花柄、花瓣1.24 mg·g-1、0.28 mg·g-1；Ⅵ時(shí)期花柄中可溶性蛋白質(zhì)含量最高，分別高于花瓣、雄蕊7.22 mg·g-1、5.84 mg·g-1。

表3 華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期花器官中可溶性 蛋白質(zhì)含量Table3 The soluble protein in male flower of Schisandra sphenanthera at different development stages

對(duì)華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期花器中可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果見(jiàn)表4。發(fā)育時(shí)期、花部位均對(duì)其可溶性蛋白質(zhì)含量存在極顯著影響（P＜0.01)。花柄中可溶性蛋白質(zhì)含量與花瓣中可溶性蛋白質(zhì)含量存在極顯著性差異 （P＜0.01)；花柄中可溶性蛋白質(zhì)含量與雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)含量差異未達(dá)顯著水平；花瓣中可溶性蛋白質(zhì)含量與雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)含量差異達(dá)極顯極著水平（P＜0.01)。Ⅲ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量與Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01)；Ⅳ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量與Ⅲ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量差異達(dá)極顯著水平 （P＜0.01)，與Ⅴ、Ⅵ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量差異未達(dá)顯著水平；Ⅴ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量與Ⅲ各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01)，與Ⅳ、Ⅵ時(shí)期各花部中可溶性蛋白質(zhì)含量差異未達(dá)顯著水平。

表4 華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期各器官中可溶性 蛋白質(zhì)含量多重比較Table4 The multiple comparisons in male flower soluble protein of Schisandra sphenanthera at different development stages

3 結(jié)論與討論

對(duì)于進(jìn)行有性生殖的雌雄異株植物，雄株開花傳粉是完成生殖繁衍的必要條件。杜慶鑫[10]認(rèn)為傳粉特性是影響花冠形態(tài)的最有效因素，兩者相輔相成；肖樂(lè)希[11]等對(duì)華鳳仙Impatienschinensis的研究認(rèn)為華鳳仙的花部特征與其蜂媒傳粉密切相關(guān)；王紅[12]等對(duì)馬先蒿屬Pedicularis花冠形態(tài)的研究，其認(rèn)為傳粉者的選擇是影響花冠類型的重要因素，花冠形態(tài)與傳粉式樣存在緊密的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。郁文彬[13]等對(duì)馬先蒿屬植物花冠形態(tài)的研究認(rèn)為，花冠的多樣性與傳粉行為關(guān)系密切。王茜等對(duì)雌雄異株的鈍葉柃的研究表明，不同性別花的花部形態(tài)和傳粉特征既有一些共同點(diǎn)，又存在著明顯差異，性別變異株則呈現(xiàn)出雌雄植株間的過(guò)渡特征[14]。鄧洪平等對(duì)雌雄異株的北碚榕的研究表明，雌雄植株在形態(tài)構(gòu)上差異顯著，雄花形態(tài)與傳粉昆蟲形態(tài)一致，雄花序內(nèi)部雄花發(fā)育的時(shí)期與傳粉小蜂的羽化成熟時(shí)期保持一致[15]。華中五味子雄花開花過(guò)程中花冠下垂并朝向地面，花瓣不完全展開，顏色艷麗，花粉在花冠展開期發(fā)育成熟，這些特征與蟲媒傳粉特征相適應(yīng)。以昆蟲為主的蟲媒傳粉植物，在昆蟲的傳粉過(guò)程中，被傳粉植物既要昆蟲幫助其完成傳粉來(lái)保證其本身的物種延續(xù)，又要盡可能地減少傳粉過(guò)程中的傷害[16]；昆蟲在傳粉的過(guò)程中，通常咬食花部器官或者吸食花蜜[17]。華中五味子雄花花托、花絲、藥隔肉質(zhì)增厚，是長(zhǎng)期受昆蟲咬食帶來(lái)的繁育壓力而進(jìn)化的結(jié)果，同時(shí)在調(diào)查時(shí)也發(fā)現(xiàn)花瓣、雄蕊有被咬食的情況，這可能與其傳粉特性相關(guān)。

在植物開花的過(guò)程中，需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而光合作用產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要以糖分的形式積累，研究發(fā)現(xiàn)糖類物質(zhì)不僅是能量的供應(yīng)者，也直接參與花芽分化的調(diào)節(jié)過(guò)程。Kinet[18]對(duì)桂香竹的研究結(jié)果表明，花春化期間，頂芽可溶性糖含量增加。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者[19-20]關(guān)于花與可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量間的關(guān)系研究大多為開花期間，葉片、根、莖中可溶性糖、蛋白質(zhì)含量的變化[21]；關(guān)于關(guān)于花本身可溶性糖、蛋白質(zhì)含量與其形態(tài)發(fā)生的關(guān)系研究較少，畢平等對(duì)棗花的研究認(rèn)為內(nèi)源激素水平對(duì)棗品種的坐果起主導(dǎo)作，而營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)生理落果起主導(dǎo)作用，但并未闡明營(yíng)養(yǎng)狀況與開花的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，華中五味子雄花花瓣、花柄上均有氣孔，這說(shuō)明花本身可進(jìn)行光合作用產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供其生殖生長(zhǎng)。華中五味子雄花不同發(fā)育時(shí)期，雄花花柄、花瓣、雄蕊中可溶性糖含量均在Ⅵ（盛開期）時(shí)期達(dá)到最大值；華中五味子同一發(fā)育時(shí)期不同部位中，雄花花瓣中可溶性糖含量最高。華中五味子不同發(fā)育時(shí)期，雄花花柄、花瓣、雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)含量先降低后升高；同一發(fā)育時(shí)期不同花部，雄花花柄、雄蕊中可溶性蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高。對(duì)比不同發(fā)育時(shí)期、不同花部中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)可溶性糖含量相對(duì)較高時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低，當(dāng)可溶性糖含量相對(duì)較低時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高?；ò晔腔ú繝I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成場(chǎng)所，而蔗糖是光合作用主要的末端產(chǎn)物，也是光合產(chǎn)物從合成場(chǎng)所向各器官移動(dòng)的主要形式，雌蕊是雌花所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最多，發(fā)育時(shí)間最長(zhǎng)，完成生殖生長(zhǎng)的關(guān)鍵部位，因此花瓣、雌蕊中可溶性糖的含量高于其他部位。當(dāng)花發(fā)育到Ⅴ（花冠展開期）時(shí)期時(shí)，花部生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量開始降低，可溶性糖含量也開始降低。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，蛋白質(zhì)的合成主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，它參與許多不同的細(xì)胞功能，雄蕊是主要的生殖器官，因此雄蕊中蛋白質(zhì)的含量高于其他部位。