梁 芳，黃秋偉，於艷萍，梁 惠，黃秋艷，劉細妹，陳秋佑，檀小輝

（1.玉林師范學院，廣西 玉林 530700；2.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001）

玉蕊Barringtonia racemosa為玉蕊科玉蕊屬植物，俗名水茄冬，棋盤腳，常綠喬木，原產(chǎn)地高可達15m，是我國稀有植物資源，分布區(qū)狹窄，生長于非洲、亞洲和大洋洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國的臺灣省及海南島都有自然分布，但數(shù)量很少，且散生居多[1-3]。玉蕊在海南常生長在海濱沿岸，有時和一些高潮位的紅樹植物混生在一起，是典型的半紅樹植物，廣東、廣西和福建沿海有少量引種。2012年廖寶文[4]在廣東雷州半島發(fā)現(xiàn)一塊有1 000 多株、集中連片的玉蕊天然次生純林。但鐘軍弟等[5]的研究發(fā)現(xiàn)雷州半島的玉蕊次生純林中低齡級和老齡級玉蕊個體數(shù)量較少，中齡級個體數(shù)量較多，玉蕊種群呈現(xiàn)衰退趨勢，且遭受潛葉蛾等蟲害，藤本植物攀援于玉蕊冠層，玉蕊生長受到威脅，以及潮水沖刷過急等諸多原因?qū)е掠袢镉酌缦蛴讟溥^渡困難，該玉蕊林成齡種群有滅絕的可能。2017年覃海寧等[6]已把玉蕊列為瀕危物種。

紅樹林生境具有高鹽、水淹低氧等特征[7],在洪澇多發(fā)地區(qū)（如沿江、沿海等）培育耐受洪澇災(zāi)害的觀賞樹種，對其景觀的營造和恢復具有重要意義[8]。目前，鹽度也是紅樹植物的一個主要環(huán)境因素，它已成為紅樹林造林成活率高低的關(guān)鍵因子。由于長期適應(yīng)潮間帶海水環(huán)境，紅樹植物形成了一套適應(yīng)于一定鹽度的耐鹽機制[9]。高鹽度會明顯阻礙植物的發(fā)育，但對紅樹植物而言，適當?shù)柠}度范圍可促進其生長發(fā)育。林鵬等[10]研究表明，紅樹植物秋茄Kenaelia candel在海水鹽度為7.5‰～21.2‰時生長旺盛。半紅樹植物與紅樹植物具有相似的生態(tài)功能，可以防風固岸、調(diào)節(jié)區(qū)域氣候、保護生物多樣性和對各種污染物進行凈化處理等[5]。部分半紅樹植物還具特殊的藥用價值和經(jīng)濟價值[11]，但目前由于海灣城市構(gòu)建等各方面的原因，現(xiàn)存半紅樹資源越來越少，半紅植物資源保護日趨緊迫，然而目前國內(nèi)外對半紅樹植物的研究還很不完善，在造林經(jīng)營上的研究尤為缺乏[12]。國內(nèi)外學者對真紅樹植物的研究較多，但對我國僅有的12 種半紅樹植物種適生鹽度研究較少，其中楊葉肖槿Thespesia populnea和海芒果Cerbera manghas、銀葉樹Heritiera littoralis、水黃皮Pongamia pinnata等半紅樹植物在抗逆性上少量研究[13-15]，另外海濱貓尾木Dolichandrone spathacea、玉蕊、蓮葉桐Hernandia sonora、苦郎樹Clerodendrum inerme4 種只做過體內(nèi)鹽分分布的比較研究[16]，而玉蕊鹽脅迫下的生理響應(yīng)以及適生鹽度研究尚未見報道。

玉蕊作為半紅樹植物之一，具有較高的觀賞價值、生態(tài)保護價值和經(jīng)濟價值[17]，在科學研究和環(huán)境保護上均具有重大意義，但由于種種原因已被列入瀕危物種，可見對其開展相關(guān)的生境保護研究、抗水淹、抗鹽育種及栽培等相關(guān)研究迫在眉睫。因此，本試驗探究潮汐系統(tǒng)下半紅樹植物玉蕊對鹽脅迫的生理響應(yīng)及其各生理指標之間的相關(guān)性，以獲得玉蕊適生的鹽度范圍，為玉蕊抗鹽育種、栽植區(qū)域及人工造林提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉蕊種子采自海南儋州市天然玉蕊林，于2016年10月在廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所育苗棚育種，出苗后起苗裝入營養(yǎng)袋，所用土壤為果園土∶椰糠=1∶1，培養(yǎng)成苗，待苗高至30±5 cm 時為試驗用苗。

1.2 試驗方法

試驗由儲水槽、植物培養(yǎng)槽，定時器、水泵、過濾系統(tǒng)、補光系統(tǒng)及遮陰系統(tǒng)等組成模擬潮汐自動控制裝置，即用定時器來自動控制各處理槽里水泵的抽水時間，以達到所設(shè)置的試驗時間梯度。試驗于2018年7月29日—8月19日在廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所溫室大棚內(nèi)進行。用自來水添加海鹽來配制不同鹽度梯度的溶液，設(shè)水體鹽度為0‰（對照，CK）、2‰、4‰、6‰、8‰、10‰、12‰，14‰共8 個處理，每處理3 個重復，每個重復6 株玉蕊幼苗。模擬半日潮，每12 h 為一個淹水周期，每個半日潮幼苗被淹沒時間為3 h，淹浸水位至枝下高。每3 d 測一次生長指標，處理21 d 后采樣，取玉蕊幼苗中上部成熟葉進行各項生理指標測定。

1.3 指標的測定

1.3.1 形態(tài)指標調(diào)查

形態(tài)指標以處理前后株高、葉片數(shù)、地徑變化情況表示，每3 d 測一次。

株高：在淹水處理前后，用卷尺測定植物株高（精確到0.1 cm），每株測定3 次，取平均值。計算株高增長量H1=淹水結(jié)束時株高－淹水開始時株高。

地徑：每株用游標卡尺東西南北方向各測定兩次（精確到0.02 mm），取平均值，測定的植株選擇同上。地徑增長量D1=淹水結(jié)束時地徑－淹水開始時地徑。

葉片數(shù)的測定：植株葉片數(shù)直觀且容易測定，直接讀取，記錄數(shù)據(jù)。葉片變化量L1=淹水結(jié)束時葉片數(shù)－淹水開始時葉片數(shù)。

1.3.2 生理指標測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）氧化法；游離脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法測定其含量。吸光值測定均采用紫外分光光度計，各指標測定方法參照《植物生理學模塊實驗指導》中方法并加以調(diào)整[18]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 整理后再用GraPhPad Prism7.0 軟件制圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0 軟件，平均值間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用鄧肯多重范圍檢驗（Duncan's multiple range test）；顯著性檢驗水平均設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高變化

由圖1可以看出，經(jīng)不同水體鹽度處理后，玉蕊株高平均總增量都有所生長，但隨著鹽度的不斷增大，各處理株高總增量呈下降趨勢（2‰鹽濃度除外），當鹽度達到12‰時達到最低值，且鹽度在4‰～12‰時株高總增長量較對照（0‰）、2‰相比呈顯著差異（P＜0.05），可見玉蕊在鹽度0‰～2‰株高增長較快，鹽度在4‰～12‰時玉蕊株高增長較為緩慢，說明不同水體鹽度對株高的生長速率有一定的影響。

2.2 地徑變化

由圖2可以看出，玉蕊幼苗地徑總體均有一定程度的增長，隨著鹽濃度的增大，玉蕊幼苗地徑總增量先增高后下降，整體呈雙峰變化，峰值出現(xiàn)在4‰、10‰，分別是對照組的126.01%、104.05%，但各處理濃度較對照組均無顯著差異。說明不同程度的鹽脅迫對地徑的增長影響不大，但地徑總增量出現(xiàn)雙峰值變化，這有可能是玉蕊通過調(diào)節(jié)地徑的增量，進而調(diào)節(jié)根冠比來不斷地適應(yīng)不同程度的鹽脅迫環(huán)境。

2.3 葉片數(shù)變化

葉片能反映植物生長和發(fā)育情況，且是對外界環(huán)境反應(yīng)較為敏感的同化器官。經(jīng)實驗觀察，處理期間玉蕊植株大部分葉片為正常綠色葉，極少部分出現(xiàn)葉尖、葉緣和葉脈變黃。隨著處理時間的增長，玉蕊少部分老葉和不成熟葉變黃脫落，成熟葉基本無脫落，生長狀態(tài)良好，因此實驗期間對植株正常光合作用和水分代謝等功能影響不大。由圖3可以看出，玉蕊葉片數(shù)變化整體呈先增加后下降的趨勢，最高值出現(xiàn)在2‰鹽度處理上，該處理葉片數(shù)變化量為正值，其他濃度處理都為負值，且最低值出現(xiàn)在10‰的鹽濃度處理上，較對照比呈顯著差異（P＜0.05），其他處理濃度2‰～8‰植株葉片數(shù)變化量較對照比均無顯著差異，說明0‰～8‰鹽度處理對玉蕊葉片數(shù)影響不大，但較高鹽度12‰、14‰時葉片脫落數(shù)反而小于10‰，說明10‰的鹽度可能是玉蕊葉片抗鹽能力的一個臨界濃度，即此時玉蕊有可能在開始啟動自身調(diào)節(jié)適應(yīng)鹽脅迫的響應(yīng)機制。

2.4 SOD 活性變化

圖3 不同鹽度對玉蕊幼苗葉片數(shù)的影響Fig.3 Effects of different salinities on leaf number of Barringtonia racemosa

圖4 不同鹽度對玉蕊幼苗葉片SOD 活性的影響Fig.4 Effects of different salinities on SOD activity in leaves of Barringtonia racemosa

由圖4可以看出，不同水體鹽度鹽脅迫下，玉蕊幼苗葉片SOD 活性的變化呈先升高后降低再升高的趨勢，在鹽度達到6‰時SOD 活性最低，10‰時達到最高值，但各處理較對照組均無顯著差異，說明隨著鹽度的增大，玉蕊幼苗葉片SOD活性的響應(yīng)并不明顯。

2.5 POD 活性變化

由圖5可以看出，不同水體鹽度脅迫對玉蕊幼苗葉片POD 活性影響較大，隨著鹽度的增大，POD 活性均明顯高于對照組，整體呈上升趨勢，且出現(xiàn)較均勻三峰變化，峰值分別在2‰、6‰、12‰三個不同鹽度上，是對照組的201.83%、214.16%、277.17%。POD 活性在12‰時達到最高值，較對照組呈顯著差異（P＜0.05）。但鹽度在0‰～10‰之間POD 值較對照均無顯著差異，說明玉蕊幼苗葉片POD 活性在不同水體鹽度脅迫下的響應(yīng)有一定的差異，其呈峰值變化可能是自身在不斷調(diào)節(jié)適應(yīng)逆境的一種響應(yīng)機制，表明玉蕊有一定的耐鹽性。

圖5 不同鹽度對玉蕊幼苗葉片POD 活性的影響Fig.5 Effects of different salinities on POD activity in leaves of Barringtonia racemosa

2.6 丙二醛（MDA）含量的變化

由圖6可以看出，隨著鹽度的增大，玉蕊幼苗葉片的丙二醛（MDA）含量整體呈上升趨勢，在鹽度12‰時達到最大值，是對照組的136.11%，呈極顯著差異（P＜0.01）。這與POD 活性變化一致，表明在鹽度為12‰時對玉蕊有一定的脅迫，此時植物啟動POD 應(yīng)對逆環(huán)境。但在鹽度2‰～10‰之間丙二醛（MDA）含量較對照組無顯著差異，說明當處理鹽度≤10‰時，玉蕊葉片細胞膜受破壞程度不大，鹽度為14‰時MDA 含量又恢復到對照水平，玉蕊幼苗表現(xiàn)出一定的抗鹽性和適應(yīng)性。

圖6 不同鹽度對玉蕊幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.6 Effects of different salinities on malondialdehyde content in leaves of Barringtonia racemosa

2.7 脯氨酸含量的變化

由圖7可以看出，隨著鹽度的增大，玉蕊幼苗葉片的脯氨酸含量整體呈上升趨勢，且由處理鹽度在0‰～10‰的緩慢升高到12‰～14‰的迅速升高變化。但當鹽度在2‰～8‰范圍時脯氨酸含量較對照組無顯著差異，說明小于8‰的鹽度處理對玉蕊的沒有造成脅迫。而當鹽度在10‰、12‰時脯氨酸含量分別是對照組的233.59%、224.84%，較對照組呈顯著差異 （P＜0.05），當處理鹽度增大到14‰時脯氨酸含量達到最高值，是對照組的681.15%，較對照組呈超顯著差異（P＜0.001），說明大于8‰的鹽度處理對玉蕊可能是一種逆境脅迫，脯氨酸含量急劇上升，表明玉蕊有較好的抗鹽性。

圖7 不同鹽度對玉蕊幼苗葉片脯氨酸含量的影響Fig.7 Effects of different salinities on proline content in leaves of Barringtonia racemosa

2.8 鹽脅迫下玉蕊生長指標的相關(guān)性分析

由表1可見，不同水體鹽度與玉蕊株高的增長呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與葉片數(shù)和地徑的變化也呈負相關(guān)，但不顯著。另外，在控制鹽濃度變量的偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下玉蕊各生長指標之間呈負偏相關(guān)，但無顯著性。表明隨著鹽濃度的不斷升高，玉蕊的形態(tài)指標均受到不同程度的抑制，其中株高的增長受到的影響最為顯著，地徑和葉片受到的影響不大。

表1 鹽脅迫下玉蕊生長指標的相關(guān)性?Table1 The correlation of growth indicators of Barringtonia racemosa under salt stress

2.9 鹽脅迫下玉蕊生理指標的相關(guān)性分析

由表2可知，不同水體鹽度與脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與POD 活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與其他生理指標相關(guān)不顯著。另外，在控制鹽濃度變量的偏相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下脯氨酸含量與丙二醛含量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），其他指標之間相關(guān)性不顯著。試驗結(jié)果表明隨著鹽脅迫的不斷增強，丙二醛隨之增大，細胞膜受到破壞，玉蕊通過快速的增加脯氨酸含量來維持細胞正常滲透壓，同時通過增強POD 來清除活性氧等有害物質(zhì)，可見脯氨酸和POD 是玉蕊抵抗鹽脅迫逆境的重要響應(yīng)指標。

表2 鹽脅迫下玉蕊生理指標的相關(guān)性?Table2 The correlation of physiological indicators of Barringtonia racemosa under salt stress

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

綜上試驗結(jié)果得知，脯氨酸、POD 是玉蕊響應(yīng)鹽脅迫的重要指標；玉蕊的適生鹽度范圍是0‰～8‰，適生的臨界鹽濃度是10‰，鹽度10‰～14‰范圍表現(xiàn)出較好抗鹽性。表明玉蕊對低濃度鹽脅迫具有一定的耐受性和適應(yīng)性。因此，可以考慮在廣西、廣東、海南、福建等部分紅樹林域，泥灘、沙灘、和灘涂地區(qū)等造林中選用玉蕊防風固沙消浪，固岸護堤、美化綠化，構(gòu)建我國海岸、河岸等綠色保護屏障。

3.2 討 論

不同程度的鹽脅迫對半紅樹植物的生長發(fā)育有顯著影響，生長量是反應(yīng)植物鹽脅迫耐受性的最直接的指標。在本研究中，所有處理的玉蕊幼苗株高、地徑均有所增長，但隨著鹽度的不斷升高，株高的增長量受到不同程度的抑制（2‰處理的植株除外），當水體鹽度為4‰～12‰時，玉蕊株高生長速率受到顯著影響，這與NaCl 脅迫后枸杞Lycium chinense株高變化相似[19]。地徑平均增量呈雙峰值變化，葉片脫落量先增大后減少（2‰處理的植株除外），這與紅花玉蕊Barringtonia acutangula在低鹽（0‰～5‰）[20]和秋茄在鹽度（0%～2%）[21]下葉片數(shù)目增加的研究結(jié)果一致。各處理的地徑和葉片數(shù)較對照組均無顯著差異，這表明水體鹽度在0‰～14‰范圍內(nèi)對玉蕊幼苗總生長量影響不大，且存在低鹽促進高鹽抑制的現(xiàn)象，這與王文卿等[22]和陳長平等[23]在研究紅樹植物木欖Bruguiera gymnorrhiza、無瓣海桑Sonneratia apetala幼苗的生長情況研究結(jié)果不同，此現(xiàn)象可能是因樹而異因地而異?？梢娪袢锞哂幸欢ǖ哪望}性，在構(gòu)建紅樹林濕地景觀上具有良好的應(yīng)用前景。

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）作為植物內(nèi)源的活性氧清除劑，屬于保護酶系統(tǒng)。鹽脅迫下，歐李Cerasus humilis植株通過增強保護酶的活性，提高總呼吸及交替呼吸速率，改變離子含量等方式提高植株的抗逆性[24]。秋茄在高鹽下啟動抗氧化防御系統(tǒng)，通過提高SOD 和POD 活性來抵御高鹽引起的氧化應(yīng)激[25]。本試驗結(jié)果中，隨著水體鹽度的不斷升高，玉蕊幼苗各處理的葉片SOD 活性一直保持在稍高于對照組水平，較對照無顯著差異。而POD 則非?；钴S，呈現(xiàn)三峰變化，最大的峰值出現(xiàn)在鹽度12‰上，這與葉片MDA 含量、脯氨酸含量變化一致，即這三個指標都在水體鹽度為12‰時顯著升高，較對照組均呈顯著差異（P＜0.05），這是玉蕊幼苗對鹽脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。玉蕊幼苗葉片受高鹽（12‰）脅迫后SOD 能與POD 協(xié)同作用，并主要啟動POD清除鹽脅迫植株體內(nèi)增多的過氧化物，這與前人研究結(jié)果相符[26,27]，可見POD 是玉蕊響應(yīng)鹽脅迫的重要指標之一，這與其同科同屬的紅花玉蕊[17]鹽脅迫的響應(yīng)指標一致。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的終產(chǎn)物，是用來衡量膜質(zhì)過氧化程度的指標之一。大量研究結(jié)果顯示，鹽脅迫下，植物葉片組織中丙二醛含量會隨鹽濃度的升高而升高[28-31]，但也有研究者發(fā)現(xiàn)，紫葉矮櫻Prunus×cistenaN.E.Hansen ex Koehne和美國紅櫨Cotinus coggyria在持續(xù)低溫脅迫下丙二醛含量呈下降趨勢[32]。本研究結(jié)果中，玉蕊受到0‰～10‰的水體鹽度脅迫后，葉片膜系統(tǒng)受損不嚴重，但當鹽度升高至12‰時葉片膜系統(tǒng)受到極顯著影響，此時POD 活性達到最大值，較對照呈顯著差異，脯氨酸也在顯著上升，可見玉蕊在應(yīng)對高鹽脅迫時主要啟動POD 抵抗和迅速提高脯氨酸含量以調(diào)節(jié)細胞滲透勢，以致在鹽度為14‰時MDA 含量又恢復到對照水平，這與彭英等[33]研究北沙參Glehnia littoralis鹽脅迫下葉片組織的膜脂過氧化水平變化相似，此時脯氨酸含量達到了最高值，這與吳竹妍等[34]的研究結(jié)果一致。表明玉蕊應(yīng)對高鹽脅迫有其內(nèi)在的響應(yīng)機制，脯氨酸是玉蕊響應(yīng)鹽脅迫的重要指標之一，這與紅花玉蕊鹽脅迫下的響應(yīng)指標一致。

通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在生長指標上，同一鹽濃度下，株高地徑葉片數(shù)相互呈負偏相關(guān)，但不顯著。不同鹽濃度下，鹽度與株高呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與地徑葉片數(shù)負相關(guān)，但不顯著，表明隨著鹽度的增大，玉蕊幼苗株高生長速率受到極顯著抑制（P＜0.01），但鹽度對地徑葉片數(shù)影響不大。在生理指標上，不同鹽度與POD 酶活、脯氨酸均呈顯著正相關(guān)，說明隨著鹽度的不斷增大，玉蕊幼苗葉片的POD 和脯氨酸含量也不斷增加，以抵抗逆環(huán)境。表明玉蕊具有較好的抗鹽性。另外，在控制鹽度下，脯氨酸含量和丙二醛含量呈顯著負相關(guān)，表明玉蕊應(yīng)對鹽脅迫通過迅速提高脯氨酸含量調(diào)節(jié)細胞滲透勢，降低了丙二醛含量，直接保護了細胞膜，這與紅樹植物小花木欖B.Parviflora[35]和白骨壤Avicennia marina[36]在高鹽脅迫下的響應(yīng)相似。

生長在海岸潮間帶的半紅樹植物和紅樹植物一樣均要面臨高鹽、水淹缺氧等復雜生境。目前在生理水平上雖有一定關(guān)于半紅樹植物對水淹和高鹽脅迫下的光合作用特性、抗氧化酶活性、生物量變化的研究，但半紅樹植物玉蕊已屬瀕危植物，且在鹽脅迫逆境中生理及分子水平上的研究尚未見報道，因此本試驗設(shè)計中只借鑒部分半紅樹植物的研究方法，有一定的局限性，試驗結(jié)果得出玉蕊在小于14‰的水體鹽度有較好的抗性，但對大于14‰的鹽度玉蕊的耐受性及適應(yīng)性如何均未知，因此對高鹽度、長時間淹水脅迫后玉蕊植株的生理響應(yīng)機制及耐鹽耐淹機理有待進一步研究，同時基于逆境脅迫后能直接與ROS 反應(yīng)，也可作為酶的底物出現(xiàn)在ROS 清除機制中的一些次級代謝物質(zhì)的研究也是非常重要的方向，以及脅迫后植物特異蛋白的合成及表達等分子水平上的相關(guān)內(nèi)容將在以后的研究中做進一步探討。