馮 景，沈永寶，史鋒厚，郭聰聰

（1.南京林業(yè)大學風景園林學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學南方現代林業(yè)協同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3.南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037；4.國家林業(yè)局南方林木種子檢驗中心，江蘇 南京 210037）

銀杏，原產中國，世界著名的孑遺樹種，被譽為“活化石”植物[1,2]。銀杏的果實俗稱白果，其種仁含有豐富的營養(yǎng)成分和多種藥用化學成分，如淀粉、蛋白質、氨基酸、黃酮類、內酯類、酚類、白果酸、多糖類、生物堿等[3]。銀杏種仁具有鎮(zhèn)咳、平喘、抗菌、抗衰老、抗癌、抗疲勞等作用，在我國又是珍貴的藥材和傳統的保健食品。植物胚胎發(fā)育過程中的細胞分化、器官形態(tài)建成的生理生化變化是研究植物胚胎發(fā)育的重要方面。銀杏作為裸子植物的遠祖，在傳粉受精及胚胎方面表現出了許多的原始特性，具有極高的理論研究價值，長期以來引起了國內外許多學者的濃厚興趣。1896年，Hirase 首先發(fā)現了銀杏的游動精子具有鞭毛，在植物學界引起了轟動。此后人們對銀杏種子發(fā)育及其受精過程的研究從未間斷。在胚胎發(fā)育過程中，碳水化合物代謝與胚胎本身分化發(fā)育密切相關[4]，而胚乳又是胚生長發(fā)育所需碳水化合物的主要供體，胚乳本身可能積極參與動員胚胎生長所需的貯藏物質[5]。對銀杏幼胚進行離體培養(yǎng)證明胚乳提取液具有促進胚生長的作用[6-8]。許多研究者從形態(tài)學、解剖學、發(fā)育生物學和遺傳學等方而對銀杏受精過程及胚乳發(fā)育特點進行了大量研究[9-16]。在其他裸子植物胚胎學的研究中，一些作者曾零星地提到胚胎發(fā)育期間某些物質的存在或消失以及它們同胚胎發(fā)育的關系[17,18]。油松胚胎發(fā)育過程中，胚乳淀粉區(qū)經常包圍著幼胚并隨幼胚的發(fā)育不斷向胚乳合點端推移，說明淀粉區(qū)是提供油松胚胎發(fā)育所需碳水化合物的主要場所[19]；杉木胚胎發(fā)育過程中蛋白質含量在胚分化完成前顯著下降[20]。

銀杏在4月下旬花粉成熟并開始傳粉，花粉傳到雌球花后不會立即受精，從傳粉到受精在暖溫帶地區(qū)大約需要112 d 左右[22]。迄今為止關于銀杏胚胎發(fā)育的大多研究集中在采后生理方面，結合種胚在樹體上的發(fā)育過程的研究尚未見報道。許多關于銀杏胚胎發(fā)育過程中尤其是胚發(fā)育過程中胚乳的物質代謝，以及胚乳與胚發(fā)育的相互關系等問題仍然沒有得到答復。銀杏胚乳在受精前已經形成，其作為種子的養(yǎng)分貯藏組織，對胚的發(fā)育十分重要，因此本研究旨在探索從種子發(fā)育開始直到胚發(fā)育完成自然脫落過程中胚乳主要內含物質的消長及胚乳發(fā)育過程中的代謝變化，這對了解銀杏胚胎的分化發(fā)育過程有著重要意義，同時也可為其他裸子植物的研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏果實采集于江蘇農牧職業(yè)技術學院校園內的3株成年母樹（32°27′38.43″N 119°56′15.64″E），品種名‘家佛指’。從2015年5月31日，即銀杏盛花期后40 d 第一次取樣。取樣時自樹冠東南西北四面隨機采集3×50 粒果實，迅速放入冰盒內帶回；此后每隔10 d 取樣一次，直到種子成熟自然脫落為止。每次取樣后，取3×30 粒剝出胚乳，縱切后去除種胚，將胚乳組織切片混勻，稱取0.3 g，每個待測生理指標重復3 次，放入-70 ℃的超低溫冰箱保存，用于后續(xù)的測定。

1.2 研究方法

1.2.1 胚長的變化

每次取回樣品后，隨機抽取3×30 粒，解剖觀察種胚的生長發(fā)育狀況并用0.01 mm 游標卡尺測量胚長度。

1.2.2 種子含水量的測定

每次取樣后，參照國際種子檢驗規(guī)程[21]，采用高恒溫烘干法測定種子的含水量。

1.2.3 胚乳內含物及相關酶活性的測定

可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法，可溶性糖、淀粉的含量測定采用蒽酮法[23]，a-淀粉酶及β-淀粉酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[23]。磷酸己糖異構酶（PGI）、G-6-PDH 和6-PGDH 聯合酶的活性測定參照Wary 和Brown 的方法[24]，蘋果酸脫氫酶活性測定參照朱廣廉法[25]。

1.3 數據處理

采用Excel 軟件處理數據、制表，SPSS23.0軟件進行方差分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 銀杏胚發(fā)育動態(tài)

8月中下旬銀杏受精作用發(fā)生，合子迅速進行連續(xù)的有絲分裂，歷經游離核和細胞化時期形成胚胎。銀杏胚分化大約經歷了一個月的時間。從9月18日即花后150 d，胚才肉眼可見，胚長2.5 mm，隨后，胚快速長大，至花后210 d，胚長為16.5 mm，之后，胚長增長緩慢，直至花后230 d（12月7日）種子自然脫落時，胚長可達17.1 mm（表1），基本充滿整個胚腔。

2.2 銀杏種子發(fā)育過程營養(yǎng)物質代謝

在花后40 d，胚乳內可溶性糖含量為1.841%，花后50～80 d 可溶性糖含量減少，由3.93%減少到2.56%，且花后80 d 可溶性糖含量（2.56%）顯著低于花后50 d（P＜0.05）（圖1），花后80～120 d 是代謝旺盛期，光合產物和能量正源源不斷地向種子運輸，可溶性糖含量持續(xù)上升到4.84%。隨后，可溶性糖的含量呈現迅速下降的趨勢,到花后140 d 時，下降到最低值2.18%。花后140 d可溶性糖含量顯著低于花后120 d，之后可溶性糖含量持續(xù)波動上升，至花后230 d 時達到7.05%。

表1 銀杏‘家佛指’種子發(fā)育過程中胚長的變化?Table1 Changes of embryo length during seed development of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

可溶性蛋白含量整體呈上升趨勢，花后40 d可溶性蛋白含量快速增加（圖2），至130 d，可溶性蛋白由1.06 mg·g-1增加至7.67 mg·g-1，隨后至170 d 可溶性蛋白有一個下降過程，這一過程正是胚發(fā)育階段，結合圖1可知，可溶性糖含量在此時期也存在一個下降過程，這可能與此時期銀杏種胚發(fā)育需要蛋白質和糖類等營養(yǎng)物質支持有關。在170 d 后，可溶性蛋白又不斷增加，至花后230 d 時達到9.28 mg·g-1。

胚乳內淀粉的含量從花后50 d 開始就呈現快速上升的趨勢（圖3），從花后50 d 的4.37%持續(xù)上升，到花后160 d 達到峰值82.5%；其中在花后120～130 d，淀粉含量短暫下降，而此時受精作用發(fā)生，這表明淀粉很可能參與了銀杏的受精過程，結合圖1和圖2可知，此期胚乳內可溶性糖含量顯著下降而蛋白質的含量顯著上升，這種情況進一步說明在受精過程中淀粉可能參與代謝并轉化為蛋白質，為胚分化發(fā)育提供支持。花后160～200 d，淀粉含量大幅波動，從胚乳內可溶性糖含量與蛋白質含量的消長情況來看，淀粉在后期胚胎發(fā)育過程中也起到了重要作用，說明淀粉在胚分化及后期胚發(fā)育過程中有明顯的積累與消耗的變化規(guī)律。自花后220 d 后銀杏胚乳內淀粉含量趨于穩(wěn)定。

2.3 銀杏種子發(fā)育過程中淀粉酶活性的變化

圖1 銀杏‘家佛指’胚乳內可溶性糖含量的變化Fig.1 Changes of soluble sugar content in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

圖2 銀杏‘家佛指’胚乳內可溶性蛋白含量的變化Fig.2 Changes of soluble protein content in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

圖3 銀杏‘家佛指’胚乳內淀粉含量的變化Fig.3 Changes of starch content in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

花后40～50 d 淀粉酶活性短暫上升，由 13.63 mg·g-1·min-1上升到21.44 mg·g-1·min-1（圖4）。 結合圖1和圖3可知，胚乳內淀粉含量在此期保持不變，而可溶性糖含量則顯著升高，這可能是由于種子發(fā)育初期，代謝較為旺盛，胚乳內淀粉的合成小于分解，淀粉酶活性升高，大量的淀粉被水解為可溶性糖類供給種子發(fā)育能量所需；花后50 d 以后，胚乳內淀粉酶活性大幅下降，到花后90 d 時，僅為5.45 mg·g-1·min-1。這與此階段可溶性糖含量迅速下降、淀粉含量快速上升相對應（圖1和圖3），胚乳內a-淀粉酶和β-淀粉酶活性與淀粉酶總活性變化相近。從花后90～180 d，胚乳內淀粉酶活性保持穩(wěn)定，而a-淀粉酶在花后140～190 d 持續(xù)升高，這個階段即胚發(fā)育階段，胚乳內可溶性糖含量也持續(xù)升高，說明a-淀粉酶在胚發(fā)育過程中起著關鍵作用。花后190～230 d，淀粉酶活性不斷升高，由5.96 mg·g-1·min-1上升到9.06 mg·g-1·min-1，表明種子發(fā)育后期，這種變化有利于為種子萌發(fā)做好準備。

2.4 銀杏種子發(fā)育過程中氧化途徑關鍵酶活性的變化

圖4 銀杏‘家佛指’胚乳內淀粉酶活性的變化Fig.4 Changes of amylase activity of in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

磷酸己糖異構酶（PGI）是糖酵解（EMP）途徑中將六碳糖轉化為丙酮酸的關鍵酶，其活性的變化能反應EMP 途徑的活化狀態(tài)。銀杏種子發(fā)育過程中胚乳PGI 活性變化如圖5所示?；ê?0～50 d，PGI 活性短暫上升，由43.46 U·g-1上升到55.33 U·g-1，此階段，胚乳生理生化反應旺盛，EMP 途徑作為植物有氧呼吸或無氧呼吸的共同途徑被激活?；ê?0～60 d，PGI 活性又迅速下降至20.36 U·g-1，結合圖3和圖5可溶性糖和淀粉在此期的變化可知，光合作用產生的可溶性糖源源不斷地轉化為淀粉，導致EMP 途徑的底物葡萄糖含量下降，從而使該途徑被短暫抑制；花后100 d，PGI 活性回升至46.93 U·g-1，這可能是由于胚乳內物質代謝迅速，此后，PGI 活性顯著下降（P＜0.05），至花后150 d 時降至最低值17.74 U·g-1，花后150～230 d，隨著銀杏種胚發(fā)育長大，PGI 活性不斷升高。

圖5 銀杏‘家佛指’胚乳內PGI 活性的變化Fig.5 Changes of phosphohexose isomerase activity in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

蘋果酸脫氫酶（MDH）是三羧酸循環(huán)（TCA）的關鍵酶，可以反映TCA 循環(huán)的活化程度，進而反映銀杏胚乳的呼吸代謝特點。如圖6所示，花后40～90 d，胚乳中MDH 的活性由0.58 U·g-1·min-1降至0.15 U·g-1·min-1（P＜0.05），花后90d～170 d，MDH 的活性不斷升高并于花后170 d 達到一個峰值，為0.40 U·g-1·min-1，MDH 活性的這種變化說明銀杏種胚發(fā)育階段需要TCA 循環(huán)產生的大量能量所支持；花后170～190 d，胚乳中MDH 的活性迅速下降至0.17 U·g-1·min-1，此后基本保持不變，這可能是由于銀杏種子發(fā)育后期，營養(yǎng)物質代謝相對緩慢，胚長大并充滿整個胚腔，胚乳的發(fā)育活動逐漸減緩，物質含量積累穩(wěn)定下來。

銀杏胚乳內葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）和6-磷酸葡萄糖脫氫（6-PGDH）聯合酶的活性呈現初期下降后上升并維持穩(wěn)定的變化趨勢（圖7）?；ê?0～70 d，G-6-PDH 和6-PGDH 聯合酶的活性由14.24 U·g-1·min-1降低到4.00 U·g-1·min-1，這可能是種子發(fā)育早期活化的糖有限，抑制了磷酸戊糖途徑的代謝?；ê?0～100 d，G-6-PDH 和6-PGDH聯合酶的活性大幅度提高，磷酸戊糖途徑代謝旺盛，推動銀杏種子胚乳內糖類合成向高貯能物質合成的轉化，這與圖7PGI 活性的變化相一致，結合圖6MDH 活性在此期的變化可知，銀杏種子發(fā)育早期胚乳內的呼吸代謝途徑以EMP 和PPP 途徑為主，而在受精及胚分化發(fā)育階段，TCA 循環(huán)發(fā)揮重要作用，花后190 d 以后，胚乳內G-6-PDH 和6-PGDH聯合酶的活性變化不明顯（P＞0.05），直至花后230 d 時，聯合酶活性為42.83 U·g-1·min-1。

圖6 銀杏‘家佛指’胚乳內MDH 活性的變化Fig.6 Changes of MDH activity in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

2.5 各指標相關性分析

對銀杏種子發(fā)育過程中胚長與各項生理指標進行相關性分析，結果表明，銀杏種子受精后，隨著種胚分化、發(fā)育長大，胚乳內的營養(yǎng)物質（糖、蛋白質、淀粉）含量和呼吸代謝關鍵酶活性均發(fā)生相應的改變。胚長與可溶性糖、蛋白質含量、淀粉酶、PGI、G-6-PDH 和6-PGDH 聯合酶的活性均呈極顯著正相關關系（P＜0.01），而與MDH 活性呈極顯著負相關關系（P＜0.01）；表明銀杏胚乳內營養(yǎng)物質的變化及多種酶的調節(jié)均對胚發(fā)育有著極顯著的作用。a-淀粉酶與淀粉含量和蛋白質含量存在極顯著正相關關系，且相關性系數均高于β-淀粉酶，說明銀杏種子發(fā)育過程中尤其是胚發(fā)育階段以a-淀粉酶為主催化淀粉水解。此外，PGI 活性與淀粉含量存在顯著正相關關系；G-6-PDH 和6-PGDH 聯合酶的活性與可溶性糖含量存在極顯著正相關關系(R2=0.721**)；MDH 活性與蛋白質含量存在極顯著負相關關系(R2=-0.911**)，這些都表明銀杏種子發(fā)育過程中多條呼吸代謝途徑不是一成不變的，酶活性調節(jié)著生理功能，而生理功能的改變在一定程度上又影響酶的活性。

圖7 銀杏‘家佛指’胚乳內G-6PDH 與6-PGDH 聯合酶活性的變化Fig.7 Changes of G-6PDH and 6-PGDH activities in endosperm of Ginkgo biloba ‘Jiafozhi’

3 討論與結論

3.1 銀杏種子發(fā)育過程中胚乳內含物及相關酶活性對胚發(fā)育的影響

種子的發(fā)育過程是一個營養(yǎng)物質不斷儲存和胚不斷發(fā)育的過程。胚乳的貯藏物質主要是碳水化合物、蛋白質和脂肪。楊國棟等通過對短絲木犀種子成熟過程中超微結構的觀察發(fā)現胚乳內含物質轉化并積累為種子營養(yǎng)物質而貯藏，是種子成熟的重要過程[26]。銀杏種子發(fā)育可分為3 個階段：1）早期發(fā)育階段（花后40～120 d）。光合作用產生可溶性糖類，這些糖類產物運輸到種子中。銀杏種子發(fā)育過程中可溶性糖、蛋白質與淀粉的含量總體呈上升趨勢，只是在花后50～80 d，可溶性糖存在一個下降的階段（P＜0.05），表明此時光合作用的產物可溶性糖類轉化為淀粉，這也使得淀粉含量上升的幅度明顯。2）受精及早期胚胎發(fā)育階段（花后120～160 d）。受精后，細胞分裂活躍，9月中旬原胚極性分化明顯，珠孔端細胞形成不發(fā)達的胚柄組織，合點端細胞分裂活躍，10月上旬逐漸分化形成子葉、胚芽、胚軸和胚根。銀杏種胚分化發(fā)育期間，胚乳內可溶性糖與蛋白質含量急劇下降，而淀粉被利用的同時其含量仍在急劇積累，在胚分化完成前（花后120～160 d）的短時期內仍緩慢地增加，雖然中間有一短暫的下降（花后130 d），但在花后160 d 時胚乳內淀粉含量才達到高峰。3）種子成熟及后期胚發(fā)育階段（花后160～230 d）。胚從母體組織中吸收糖類等營養(yǎng)，胚乳獲得營養(yǎng)物質的多少，直接影響胚的發(fā)育[29]。

在許多植物中發(fā)現，種胚發(fā)育時，淀粉在胚和胚乳內積累過程中，同時被降解用來作為胚胎組織分化發(fā)育所需要的能量，以及合成蛋白質等結構與貯藏物質的骨架[27-35]；當生長和發(fā)育可用的碳庫經歷巨大波動時，植物會通過積累和重新調動淀粉作為碳庫來緩減碳平衡的變化[36]。銀杏種胚在利用淀粉的過程中，淀粉酶活性也在不斷增加，種胚分化完成后，胚內淀粉含量急劇下降，這主要是淀粉酶對淀粉降解作用的結果，a-淀粉酶在后期胚發(fā)育過程（花后170～190 d）中持續(xù)升高，而β-淀粉酶此期變化始終不明顯，表明a-淀粉酶在銀杏種胚發(fā)育后期的調節(jié)作用可能有利于胚在相對穩(wěn)定而且較充分的營養(yǎng)環(huán)境下正常發(fā)育。銀杏胚乳內可溶性糖和蛋白質的積累一直分別持續(xù)到花后220 d 和190 d，即它們含量的高峰期分別比淀粉含量高峰期推遲了60 d 和30 d 左右，且胚乳內的淀粉含量在花后160～210 d 處于大幅波動的狀態(tài)，淀粉不斷累積和被利用，表明其可能參與了胚胎發(fā)育的代謝過程[37-39]，并對胚發(fā)育所需營養(yǎng)和貯藏起到“橋梁作用”[40]。這在銀杏的相關研究中尚未見報道。

3.2 銀杏種子發(fā)育過程中胚乳內氧化途徑關鍵酶活性變化

呼吸作用是植物代謝的中心，植物體中存在多條呼吸代謝途徑，主要有糖酵解（EMP）途徑、三羧酸（TCA）循環(huán)、戊糖磷酸（PPP）途徑。這些途徑的關鍵酶，在催化糖類物質分解產生能量外，還形成中間產物，為合成脂類、蛋白質等提供原料來源。

糖類在糖酵解（EMP）途徑中被代謝是呼吸作用產生能量的第一步[41]，通過EMP 的一系列反應，葡萄糖氧化釋放能量并形成ATP 和NADH+H+，最終生成丙酮酸（PA）。在銀杏種子發(fā)育的早期階段（花后40～120 d），EMP 途徑首先被激活，胚乳內PGI 活性波動較大，這與可溶性糖含量的變化相對應，可溶性糖向淀粉轉化使EMP 途徑底物含量下降，從而導致花后50～60 d PGI 活性短暫下降，同時，PGI 也受到AMP，ADP 和ATP 的調控，當ATP 的需求增加時，糖酵解速率也會加快[42,43]?；ê?0～100 d，銀杏胚乳內物質代謝旺盛，積累較多的ADP 和Pi，PGI 活性快速上升，EMP 速度加快。NADH是TCA 循環(huán)的主要負效應物，NADH 積累過多，會抑制MDH 的活性，因此在銀杏種子發(fā)育的早期階段，TCA 循環(huán)隨著EMP 的激活而處于抑制狀態(tài)。而此期G-6PDH 和6-PGDH 聯合酶的活性顯著升高，PPP 途徑被激活，并在在受精后及早期胚胎發(fā)育階段（花后120～160 d），維持在很高的水平。而EMP/TCA 循環(huán)的酶體系在此期被顯著抑制，PPP 途徑具有一套完全區(qū)別于EMP/TCA 循環(huán)的酶體系，常與植物生長發(fā)育和逆境應答有關，當“干線”的酶體系沒有充分活化時，戊糖磷酸途徑往往作為替補途徑，行使有氧呼吸的職能，保證植物細胞正常生命活動所需能量的供應[44-46]。PPP 途徑中的6-PGDH 是胚乳內淀粉積累的關鍵酶[47]，而且，該途徑產生大量NADPH，提供還原力，其中間產物核酮糖-5-磷酸還是合成RNA 和DNA的關鍵原料，受精及胚分化過程也是遺傳物質的大量合成的時期，因此這一途徑對銀杏胚發(fā)育的作用之大不言而喻。TCA 循環(huán)是有機體獲得能量的最主要的途徑，同時它也是物質代謝的樞紐，底物徹底氧化產生的能量主要也是通過TCA 循環(huán)，每個葡萄糖分子通過TCA 循環(huán)產生的ATP 數遠遠超過EMP 途徑產生的ATP 數[41]。番木瓜果實發(fā)育后期，以線粒體呼吸占絕對優(yōu)勢，而線粒體外呼吸則變?yōu)榇我猍48]。在油菜籽實形成過程中，呼吸途徑由EMP 途徑逐漸轉為PPP 途徑[49,50]。銀杏種子成熟及后期胚發(fā)育過程中，MDH 的活性不斷升高并于花后170 d 達到一個高峰，表明銀杏幼胚后期發(fā)育長大過程需要大量能量，而胚乳內淀粉含量在花后160～170 d 顯著下降，進一步說明在銀杏胚后期發(fā)育過程中胚乳內淀粉可能起著物質和能量供應的重要作用。銀杏種子發(fā)育各階段呼吸途徑變化的大致規(guī)律可以歸納如下：種子早期發(fā)育階段，EMP 途徑首先被激活；PPP 途徑隨之活化并作用顯著，在受精后及胚分化階段，PPP 途徑活化程度不斷推進并維持在較高水平；在種子成熟及后期胚胎發(fā)育階段，TCA 循環(huán)發(fā)揮重要作用。

本文僅探究了胚乳中內含物質的代謝變化，沒有探究內源激素含量變化，將來可進一步探究胚中物質代謝，從代謝組學或蛋白質組學等方面深入研究，全面考察其與胚發(fā)育的關系。