劉珍妮，李明慧，駱 鈺，劉秉琿，黃詩杭，吳寶成,2，黃一帆,2*，吳異健,2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室，福建福州350002)

循環(huán)中淋巴細(xì)胞選擇性穿越高內(nèi)皮微靜脈(High endothelial venule，HEV，又稱毛細(xì)血管后微靜脈)定向游動稱為淋巴細(xì)胞歸巢，包括淋巴干細(xì)胞向中樞淋巴細(xì)胞器官歸巢，成熟淋巴細(xì)胞向外周淋巴器官歸巢[1]。通過淋巴細(xì)胞的歸巢，可以使黏膜局部的免疫效應(yīng)細(xì)胞游走到全身各處，進(jìn)而使得局部免疫接種可以廣泛引發(fā)其它黏膜組織免疫應(yīng)答[2]。而整合素是介導(dǎo)淋巴細(xì)胞向腸黏膜遷移的重要分子[3]。整合素是一種膜鑲嵌卵白，由α 和β 亞基連接形成異二聚體，α4 整合素包括α4β1 和α4β7 兩種[4]。前者主要介導(dǎo)淋巴細(xì)胞向發(fā)生炎癥的部位聚集和遷移，從而參與多種病理反應(yīng)。后者主要在黏膜中淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞中表達(dá)，與黏膜地址素黏附分子(Mucosal Addressin cell adhesion Molecule-1，MAdCAM-1)相互作用，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的歸巢并參與該過程中的免疫應(yīng)答。

番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)感染能夠引起番鴨機(jī)體的免疫抑制，并破壞番鴨腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和黏膜免疫功能，對番鴨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[5]。本實驗室前期研究表明MDRV 感染引起的雛番鴨腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和黏膜免疫功能的損傷與淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)[6-7]，本研究擬通過對整合素的示蹤進(jìn)一步探明MDRV 感染對淋巴細(xì)胞歸巢的影響及其機(jī)制。目前國內(nèi)關(guān)于番鴨整合素α4 的相關(guān)研究相對較少，尚無番鴨整合素α4 的商品化抗體，為此本實驗在原核表達(dá)番鴨整合素α4 亞基的基礎(chǔ)上制備抗體，并通過western blot 方法及間接免疫熒光(IFA)組化檢測方法對MDRV 感染番鴨淋巴細(xì)胞后α4 蛋白表達(dá)水平及定位的變化進(jìn)行分析，為開展α4 蛋白的功能和調(diào)控機(jī)制研究，以及為抗病毒新策略研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 MDRV 為本實驗室分離鑒定[8]；pET-32a(+)原核表達(dá)載體由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α 和BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自TransGen Biotech；健康成年的福建黃兔購自福建農(nóng)林大學(xué)兔園；MDRV 抗原抗體雙陰性健康雛番鴨購自福建莆田溫室鴨場。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司；膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)和質(zhì)粒小提試劑盒(Plasmid Mini Kit)購自O(shè)mega 公司；2×EsTaqMaster Mix、EcoRⅠ和SalⅠ購自TaKaRa 公司；RNA提取試劑盒(TransZol Up Plus RNA Kit)、T4 DNA 連接酶、蛋白Marker (Blue Plus Protein Marker)、ProteinIso Ni NTA Resin 蛋白純化系統(tǒng)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、PE 標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG (IgG-HRP)和山羊抗鼠IgG-HRP、Anti-His Mouse MAb 購自TransGen Biotech；外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；σA 抗體為本實驗室制備[9]；羧基熒光素乙酰乙酸(CFSE)購自北京索萊寶科技有限公司；PE 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗購自武漢艾美捷科技有限公司；4',6- 二脒基-2- 苯基吲哚(DAPI)購自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)α4 基因序列(XM027461081)，選擇750 bp (928 bp～1 677 bp)α4亞基片段基因設(shè)計1 對特異性引物，α4F：5'-CCGG AATTCATGCTAAGTACCATCAGAGAGGA-3' (EcoRⅠ)/α4R： 5'-ACGCGTCGACTTATGCTTCAACATGT ATAGGAG-3' (SalⅠ)；設(shè)計1 對pET-32a(+)原核表達(dá)載體的特異性檢測引物P6，P6F：5'-CGACGAC AAGGCCATGGCTG-3'/P6R： 5'-TTAGCAGCCGGAT CTCAGTG-3'。引物均由上海尚亞生物公司合成。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá) 無菌條件下解剖健康番鴨，采集十二指腸作為樣本，按照試劑盒操作提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以該cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增α4 亞基的部分編碼序列。PCR 反應(yīng)體系為：2×PCRTaqMix 酶12.5 μL，α4F 和α4R 引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，DEPC水補(bǔ)至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃1 min，32 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %凝膠糖凝膠電泳檢測并切膠回收α4 亞基目的片段，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物750 bp。目的片段經(jīng)EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切后克隆至pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-His-α4。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后經(jīng)測序鑒定。

將pET-His-α4 轉(zhuǎn)化BL21，加IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)2 h 后離心收集菌體，加1×protein Buffer 充分混勻，煮沸10 min，冰上冷卻2 min，4 ℃，12 000 r/min 離心2 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE 分析。另取適量誘導(dǎo)后的菌超聲波破碎，離心，以Anti-His Mouse MAb 為一抗(1∶4 000)，山羊抗鼠IgG-HRP 為二抗(1∶8 000)，進(jìn)行western blot鑒定。利用Ni2+柱對表達(dá)重組蛋白進(jìn)行純化，測定濃度后-80 ℃保存。純化的重組蛋白命名為rHis-α4。

1.5 多克隆抗體制備及效價測定 首免前，兔耳緣靜脈采血分離血清作為陰性血清備用。將純化的rHis-α4 與弗氏完全佐劑等體積充分乳化后，背部皮下多點注射福建黃兔(1.0 mg/ 只)，2 周后改用弗氏不完全佐劑乳化該重組蛋白質(zhì)(1.0 mg/ 只)，每隔2周免疫一次，免疫3 次，心臟采血、分離血清。利用碳酸鹽緩沖液稀釋的rHis-α4 蛋白(20 μg/mL)包被酶標(biāo)板，以免疫前的兔血清為陰性血清，取1∶500～1∶512 000 經(jīng)2 倍倍比稀釋的抗rHis-α4 的多克隆抗體為一抗，以山羊抗兔IgG-HRP (1∶1 000)為二抗，TMB 為底物顯色，間接ELISA 方法檢測多克隆抗體的效價，以待檢血清孔的OD450nm值/ 陰性血清孔的OD450nm值≥2.1 判為陽性。設(shè)置rHis-α4 為500μg/mL，加于中央孔，40 μL/ 孔。其它孔加入2 倍倍比稀釋的上述制備的兔陽性血清，并設(shè)置陰性血清對照。采用瓊脂雙向擴(kuò)散法檢測該多克隆抗體效價。

1.6 MDRV 感染后的體外番鴨淋巴細(xì)胞整合素α4表達(dá)水平的檢測 取MDRV 抗原抗體雙陰性雛番鴨心臟采血10 mL～20 mL，按照鴨外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒操作，從番鴨的血液中分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至107個/mL 備用。將MDRV 接種于分離的淋巴細(xì)胞，分別于接種病毒后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 和48 h 收樣。提取細(xì)胞蛋白經(jīng)SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)印、封閉，以制備的抗rHis-α4 兔源多克隆抗體為一抗(1∶4 000)，山羊抗兔IgG-HRP 為二抗(1∶8 000)，進(jìn)行western blot 鑒定，利用Image J軟件分析蛋白的灰度值，計算出α4/β-actin 的值，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS11.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差進(jìn)行差異顯著性分析，LSD 法比較差異顯著性。

1.7 MDRV 感染對雛番鴨淋巴細(xì)胞歸巢至盲腸腸道黏膜影響的IFA 鑒定 將6 只1 日齡番鴨隨機(jī)分為空白對照組(MOCK 組)和MDRV 感染組(MDRV組)，每組3 只。利用活細(xì)胞染料CFSE 標(biāo)記分離的番鴨淋巴細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)染色法確定淋巴細(xì)胞活性大于95 %后，按番鴨每克體重2×105個淋巴細(xì)胞的比例通過番鴨肱靜脈注射入番鴨體內(nèi)。MDRV 感染組番鴨腿部肌肉注射MDRV。接種病毒后兩組獨立飼養(yǎng)，自由飲水采食。MDRV 感染第6 d，取空白組和MDRV 感染組番鴨的末端盲腸組織，制備切片，以本實驗制備的抗rHis-α4 兔源多克隆抗體(1∶100)為一抗，以PE 標(biāo)記的山羊抗免IgG 為二抗(1∶1 000)，室溫避光靜置，PBS 洗滌，DAPI 避光染色5 min，PBS 洗滌，甘油封片(避光，滴加防淬滅劑)，在共聚焦顯微鏡下觀察。以IFA 方法檢測MDRV 對雛番鴨盲腸中α4 蛋白的表達(dá)和淋巴細(xì)胞歸巢的影響。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)載體pET-His-α4 的構(gòu)建與鑒定 以番鴨腸道組織cDNA 為模板，α4F/α4R 為引物，擴(kuò)增得到約750 bp 的α4 特異性片段(圖1A)，將其克隆至pET-32a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-His-α4，用質(zhì)粒引物P6F/P6R 進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到約900 bp 的pET-His-α4 PCR 產(chǎn)物(α4 片段750 bp和質(zhì)粒部分片段150 bp)，與預(yù)期相符(圖1B)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示目的基因插入位置、序列和讀碼框正確，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-His-α4 正確構(gòu)建。

2.2 重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定結(jié)果 將pET-His-α4 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌，加入IPTG 誘導(dǎo)后，SDS-PAGE 結(jié)果顯示表達(dá)出了一條約45 ku 的蛋白條帶(His 和α4 的融合蛋白)。經(jīng)純化后的蛋白濃度約為1.3 mg/mL。Western blot 檢測結(jié)果顯示，在45 ku 處出現(xiàn)一條蛋白條帶，與預(yù)期一致(圖2)，表明目的融合蛋白正確表達(dá)。

2.3 抗rHis-α4 多克隆抗體的制備及效價檢測實驗兔經(jīng)基礎(chǔ)免疫和加強(qiáng)免疫后，耳緣靜脈采血，收集血清，以純化的rHis-α4 蛋白為抗原，采用常規(guī)的間接ELISA 法測定制備的α4 兔多克隆抗體血清效價，當(dāng)兔多克隆抗體稀釋512 000 倍時，P/N≥2.1，結(jié)果顯示其效價大于1∶512 000，瓊脂結(jié)果顯示，免疫血清抗體的瓊擴(kuò)效價達(dá)1∶32 (圖3)。間接ELISA 和瓊脂雙向擴(kuò)散試驗結(jié)果表明本實驗制備的α4 兔多克隆抗體具備較高的效價，目的蛋白有良好的免疫原性。

圖1 整合素α4 亞基載體pET-His-α4 的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of pET-His-α4

圖2 rHis-α4 蛋白純化結(jié)果的SDS-PAGE(A)和western blot(B)分析Fig.2 SDS-PAGE (A)and western blot analysis (B)of the purified rHis-α4

2.4 MDRV 感染對體外番鴨淋巴細(xì)胞表達(dá)α4 蛋白水平的影響 采用western blot 方法檢測MDRV 感染后的體外番鴨淋巴細(xì)胞α4 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，病毒感染組細(xì)胞中α4 蛋白含量在MDRV 感染3 h～12 h 持續(xù)上升，12 h 達(dá)到峰值；空白對照組細(xì)胞中α4 蛋白含量在3 h～24 h 持續(xù)上升，24 h達(dá)到峰值；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，除48 h，各個時間點MDRV 感染組細(xì)胞α4 蛋白的表達(dá)水平顯著或極顯著(p＜0.05 或p＜0.01)高于空白對照組(圖4)。結(jié)果表明MDRV 可以誘導(dǎo)感染的體外番鴨淋巴細(xì)胞表達(dá)α4 蛋白。

圖3 兔抗rHis-α4 多克隆抗體瓊脂雙向擴(kuò)散試驗結(jié)果Fig.3 AGAR bidirectional diffusion test results of rabbit anti-rHis-α4 antibody

圖4 MDRV 感染番鴨淋巴細(xì)胞后對α4 蛋白表達(dá)水平影響的檢測結(jié)果Fig.4 Effect of MDRV on the expression level of integrin α4 protein in lymphocytes of Muscovy duck

2.5 CFSE 活細(xì)胞染色 10 μmol/L CFSE 標(biāo)記終濃度條件下，選用PBS 為孵育液，對番鴨淋巴細(xì)胞進(jìn)行CFSE 標(biāo)記。CFSE 標(biāo)記淋巴細(xì)胞后，普通熒光鏡下可見直徑9 μm～12 μm 的圓形淋巴細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可見帶有綠色熒光(圖5B)。

圖5 顯微鏡觀察CFSE 標(biāo)記番鴨淋巴細(xì)胞(×100)Fig.5 Microscopic observation of CFSE - labeled lymphocytes of Muscovy duckling (×100)

2.6 MDRV 感染對雛番鴨淋巴細(xì)胞歸巢至盲腸腸道黏膜的影響 將CFSE 標(biāo)記后的淋巴細(xì)胞(即CFSE+淋巴細(xì)胞)通過肱靜脈注射入番鴨體內(nèi)，在MDRV 感染第6 d，取空白組和MDRV 感染組番鴨的末端盲腸組織制備切片，觀察CFSE+淋巴細(xì)胞在盲腸的分布情況及α4 在這些CFSE+淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況。IFA 結(jié)果顯示，MDRV 感染組番鴨CFSE+(綠光)和α4+(紅光)淋巴細(xì)胞均多于空白組番鴨，且α4 蛋白(紅光)與CFSE 信號(綠光)在盲腸部位的淋巴細(xì)胞重合形成黃光(圖6)，表明CFSE+淋巴細(xì)胞在表達(dá)了整合素α4 的同時向盲腸歸巢，同時表明了在MDRV 感染雛番鴨后促進(jìn)淋巴細(xì)胞歸巢的過程與整合素α4 的表達(dá)有關(guān)。

圖6 α4 蛋白番鴨盲腸組織淋巴細(xì)胞定位的免疫熒光檢測Fig.6 Lymphocytes localization of cecum detected by immunofluorescence

3 討 論

整合素α4 是淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)的一個蛋白受體，能夠與MAdCAM-1 配體結(jié)合而使得淋巴細(xì)胞達(dá)到歸巢目的[10]。腸道自身的淋巴組織產(chǎn)生腸道淋巴細(xì)胞，這些新產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞在離開腸道組織之后，進(jìn)一步發(fā)育成熟，經(jīng)淋巴循環(huán)回到腸道淋巴組織定居，發(fā)揮小腸黏膜免疫反應(yīng)的作用[11]，而盲腸是番鴨體內(nèi)淋巴細(xì)胞一個重要的歸巢部位。為研究α4 蛋白與MDRV 感染誘導(dǎo)腸道淋巴細(xì)胞歸巢的相互關(guān)系，本實驗首次構(gòu)建了pET-His-α4 重組表達(dá)質(zhì)粒，并原核表達(dá)了重組番鴨整合素α4 蛋白，制備了抗rHis-α4 兔源多克隆抗體。利用該多克隆抗體進(jìn)行相應(yīng)的western blot 和IFA 檢測。Western blot 結(jié)果顯示，MDRV 感染誘導(dǎo)體外番鴨淋巴細(xì)胞中整合素α4 大量表達(dá)；IFA 組化實驗檢測結(jié)果顯示MDRV感染的雛番鴨盲腸α4+(紅光)和CFSE+(綠光)淋巴細(xì)胞呈增加趨勢，且兩種熒光信號重合形成黃光，這表明MDRV 感染促進(jìn)了整合素α4 的表達(dá)的同時還導(dǎo)致了歸巢至盲腸黏膜的淋巴細(xì)胞增加。以上結(jié)果表明雛番鴨感染MDRV 后誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢受體α4 表達(dá)，增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞滾動和跨內(nèi)皮遷移，以調(diào)控淋巴細(xì)胞歸巢至腸黏膜。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面整合素分子通過與其配體作用將細(xì)胞穩(wěn)定粘附于血管壁，而只有表達(dá)α4β7的細(xì)胞才有可能進(jìn)入粘膜部位，參與一些炎癥反應(yīng)，并對腸相關(guān)淋巴組織的發(fā)育、粘膜部位的免疫應(yīng)答等有重要作用[12]。也有研究表明整合素α4β1含量升高能夠使淋巴細(xì)胞聚集在腸道，引起腸道炎癥和加劇疾病嚴(yán)重程度[13]。淋巴細(xì)胞歸巢是淋巴細(xì)胞遷移的一種特殊方式，對機(jī)體有利有弊。當(dāng)MDRV 感染后，24 h～36 h 可引起機(jī)體腸道黏膜出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，機(jī)體出現(xiàn)免疫應(yīng)答。嚴(yán)重感染時，造成腸道黏膜結(jié)構(gòu)的破壞、黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的減少，引起免疫屏障功能的嚴(yán)重?fù)p傷[14]。而本研究發(fā)現(xiàn)MDRV 感染后α4+淋巴細(xì)胞增加，效應(yīng)T 細(xì)胞更多的向黏膜部位遷移。因此，MDRV 感染后雛番鴨腸道黏膜免疫系統(tǒng)被破壞可能與MDRV 感染導(dǎo)致α4+淋巴細(xì)胞增加促進(jìn)的腸道淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，MDRV 感染促進(jìn)腸道炎性介導(dǎo)活性因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達(dá)，機(jī)體免疫平衡被破壞，加速腸道局部炎癥反應(yīng)，該過程與淋巴細(xì)胞歸巢至腸道黏膜從而參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDRV 感染誘導(dǎo)雛番鴨α4+淋巴細(xì)胞增加，促進(jìn)了大量淋巴細(xì)胞歸巢至腸黏膜，從而導(dǎo)致番鴨腸道出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，腸道黏膜結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，機(jī)體免疫功能出現(xiàn)障礙。

本實驗首次制備了番鴨整合素α4 亞基兔源多克隆抗體，該抗體可以用于番鴨整合素α4 亞基示蹤的相關(guān)研究，為MDRV 感染誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢與其機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。