王曉寧,江成龍,刁紅錄,張昌軍

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，湖北十堰 442000)

在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技術中,經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵術是IVF助孕的常規(guī)收集卵子的方法。穿刺取卵術的效果與手術者取卵術熟練程度、有效的負壓抽吸、穿刺取卵針直徑大小、卵泡的成熟度、注射HCG時卵泡徑線的大小都有關系，本中心自2014年使用經(jīng)典長方案促排卵并在取卵術中使用單腔取卵針進行取卵以來,反復總結并積累經(jīng)驗,獲卵率及回收卵母細胞質量得到較高保證。本研究對陰道超聲引導下穿刺取卵術與妊娠結局的關系進行了回顧性比較，探討經(jīng)陰道穿刺取卵術中合適的取卵手術時間，減輕患者的痛苦，并獲取高質量的卵母細胞，進而得到高質量的胚胎以提高臨床妊娠率。

1 資料與方法

1.1研究對象 回顧性分析2014年11月至2015年11月在本院生殖醫(yī)學中心因男方精子質量較差單因素尋求輔助生殖治療的IVF-ET周期的資料共188例,納入標準:女方年齡20～35歲;月經(jīng)規(guī)則;B超監(jiān)測有排卵;應用標準長方案超促排卵,并由同一醫(yī)生行取卵術。其按照平均每個卵子獲卵時間為1.2 min分為<1.2 min組和≥1.2 min組進行比較。

1.2方法

1.2.1促排卵方法 采用標準長方案促排卵,從上1個月經(jīng)周期的黃體中期(月經(jīng)第21天)開始使用醋酸曲普瑞林(德國輝凌制藥有限公司)0.05 mg/d 長方案行垂體降調節(jié),至月經(jīng)第3～5天垂體降調節(jié)達標后,加用促性腺激素[Gn,重組人促卵泡刺激(r-hFSH),瑞士雪蘭諾制藥公司,75 IU/d]或(和)尿促性素(hMG,麗珠集團麗寶生物化學制藥有限公司)行超促排卵,促排卵期間B 超監(jiān)測卵泡的發(fā)育情況,當直徑達16～18 mm的卵泡大于2個時,停用r-hFSH和hMG,注射重組人絨促性素(r-hCG,瑞士雪蘭諾制藥公司)250μg,36 h 后在B超引導下行穿刺取卵術。

1.2.2取卵 患者取膀胱截石位,手術在陰道超聲引導下進行。陰道B 超(日本Aloka SSD-900型超聲診斷儀),陰道探頭頻率7 MHz； 常規(guī)消毒,鋪巾,局部麻醉鎮(zhèn)痛后放入陰道探頭及穿刺架,徹底掃描盆腔,了解子宮、卵巢的位置和可及度,并確定進針位置。用單腔取卵針(美國COOK公司)，抽吸的卵泡液遞進胚胎實驗室由技術人員在體式顯微鏡下尋找卵冠丘復合體。記錄取卵時間,并對所回收卵母細胞質量及胚胎質量進行評分。

1.2.3受精與胚胎培養(yǎng) 受精后16～18 h觀察原核情況，若出現(xiàn)兩原核判斷為正常受精。受精后胚胎在體外培養(yǎng)24～48 h，于取卵后的第3天根據(jù)文獻[1]對移植胚胎進行胚胎形態(tài)學評分，Ⅰ～Ⅱ為優(yōu)質胚胎，Ⅰ～Ⅲ級胚胎均為可用胚胎，Ⅲ以上進行囊胚培養(yǎng)，移植D5囊胚，采用 B 超引導下的宮腔內(nèi)移植。妊娠的標準是胚胎移植后第14天血清人絨毛膜促性腺激素(hCG)陽性為生化妊娠，臨床妊娠為第4周B超檢查有胎心搏動。優(yōu)質胚胎率=優(yōu)胚數(shù)/胚胎數(shù)×100%，可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/胚胎數(shù)×100%，囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%。

1.2.4激素檢測 內(nèi)分泌檢測：控制性超促排卵周期中hCG注射日早晨抽取靜脈血,應用 DXI800全自動電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(美國貝克曼庫爾特公司) 進行內(nèi)分泌(血清激素FSH、E2、P、LH)的測定。相應試劑盒購自武漢德高科技有限責任公司，操作按試劑盒說明書要求進行，控制試劑批內(nèi)及批間差異10%以內(nèi)。

1.2.5相關參數(shù)計算標準 可移植胚胎率=可移植胚胎數(shù)/卵裂正常受精卵數(shù)×100%。優(yōu)質胚胎率=優(yōu)質胚胎數(shù)/卵裂正常受精卵數(shù)×100%。流產(chǎn)率=流產(chǎn)患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100%。受精率=2原核或以上受精卵母細胞數(shù)/卵母細胞數(shù)×100%。卵裂率=卵裂正常(2原核)受精卵數(shù)/正常受精(2原核)卵母細胞數(shù)×100%。獲卵率=卵母細胞數(shù)/穿刺卵泡數(shù)×100%。成熟卵率=成熟卵母細胞數(shù)/卵母細胞數(shù)×100%。

2 結 果

2.1一般情況比較 兩組患者的平均年齡、不孕年限、BMI、Gn用量、Gn用藥時間、移植胚胎數(shù)目差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 患者一般情況比較

2.2取卵手術時間與相關參數(shù)相關性分析 取卵手術時間與年齡、既往腹部手術史、Gn用量正相關(P<0.05)，與優(yōu)胚數(shù)、取卵后孕激素水平、活產(chǎn)率呈負相關(P<0.05)，與BMI、Gn時間、夜針日LH、夜針日雌激素、夜針日P、取卵后LH、取卵后雌激素、臨床妊娠無明顯相關性(P>0.05)，見表2、3。

2.3不同妊娠結局的取卵手術時間分析 活產(chǎn)組每組[102例，(1.23±0.71)min]與流產(chǎn)組[13例，(1.49±0.61)min]相比，妊娠組[116例，(1.27±0.71)min]與非妊娠組[72例，(1.32±0.93)min]相比，取卵手術時間無明顯相關性(P>0.05)。

表2 取卵手術時間與相關參數(shù)的Person相關分析

表3 取卵時間與相關參數(shù)的Spearman相關分析

2.4取卵手術時間對妊娠結局的影響 不同取卵手術時間hCG日平均FSH、E2、LH水平均差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。<1.2 min組hCG日P水平、獲卵數(shù)、獲卵率、優(yōu)質胚胎率顯著高于≥1.2 min組，流產(chǎn)率顯著低于≥1.2 min組(P<0．05)，見表4。

表4 不同取卵手術時間與妊娠結局比較

續(xù)表4 不同取卵手術時間與妊娠結局比較

3 討 論

超聲引導下經(jīng)陰道穿刺抽吸取卵已經(jīng)成為輔助生殖中獲得卵子的最佳途徑。但是在實際臨床工作中，常常存在部分患者獲卵時間長的現(xiàn)象，獲卵時間的長短與患者自身病史、卵子成熟度、HCG作用時間、卵泡沖洗次數(shù)及操作者的熟練程度可能都有關系。

目前取卵手術使用的穿刺針分單腔和雙腔兩種，雙腔穿刺針在使用過程中可以有一個腔抽吸卵泡液，另外一個腔抽吸卵子，但是這樣可能增加卵子暴露時間，且沖洗次數(shù)不一樣可能增加干擾因素[2-3]。此外，有研究表示，卵泡沖洗并不能提高有效卵子數(shù)以及有效胚胎數(shù)[4-5]。本研究選取同一方案的患者，且操作者為同一人，都是使用單腔取卵針，避免了由于客觀因素引起的干擾。

已有文獻證實，卵子對溫度、pH 及滲透壓等外界環(huán)境非常敏感,輕微的變化即可引起不可逆改變[6-8]。增加取卵手術時間，可能延長卵母細胞卵泡暴露時間,從而導致卵母細胞形態(tài)異常率增高。本研究按照納入人群平均獲取單個卵泡所需時間的平均值將其分為兩組，從研究中可以發(fā)現(xiàn)，分組后兩組的一般情況并沒有明顯差異。

目前國內(nèi)外的研究中對于取卵手術時間與妊娠結局的影響尚少有報道，本研究中通過探討平均每個卵子手術時間與妊娠結局的關系為臨床操作提供參考，為如何提高獲卵效率，改善妊娠結局奠定基礎。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，平均每個卵子獲卵時間<1.2 min組平均獲卵數(shù)、獲卵率、優(yōu)質胚胎率均高于≥1.2 min組，兩組之間妊娠率、活產(chǎn)率無明顯差異，分析原因可能由于這些卵子成熟度好，卵丘與卵泡壁連接疏松，容易從卵泡壁剝離下來，導致取卵容易，獲卵時間短，從受精后結局來看，增加單個卵泡手術時間并不能增加獲卵率、優(yōu)胚率，臨床妊娠率也沒有明顯改善，提示提高手術的熟練程度以及實驗室人員的配合能力，盡量縮短手術時間可能更有利于改善助孕結局。此外，平均每個卵子獲卵時間≥1.2 min組hCG日P水平增加，分析原因可能與該組患者卵泡過早黃素化有關。有研究發(fā)現(xiàn)，過早黃素化可能損害卵子、胚胎質量，誘導卵母細胞過早恢復減數(shù)分裂，使子宮內(nèi)膜過早向分泌期轉化，影響子宮內(nèi)膜容受性，從而降低臨床妊娠率[9-10]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)臨床妊娠率受到影響，但是子宮內(nèi)膜容受性降低可能導致流產(chǎn)率增加，與文獻[11]報道一致。此外，≥1.2 min組流產(chǎn)率增加可能與取卵手術過程中對于顆粒細胞的損傷大，取卵術后患者黃體功能相對差有關。故本研究認為，延長取卵手術時間不影響胚胎質量和妊娠結局，但當單個卵泡手術時間小于1.2 min可能提高者的胚胎質量，降低流產(chǎn)率。

另外需要排除不均一性的因素，如：患者卵巢功能、培養(yǎng)基量不同等。因此在取卵操作過程中把握每一個環(huán)節(jié)，控制在最短的時間內(nèi)獲得卵子，一方面需要提高取卵手術者的技能水平，另一方面促排方案的合理應用，使顆粒細胞疏松化，卵子成熟度達到同步化，才能提高取卵效率，獲得理想的結局。