(天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402)

一、前言

星星草(Puccinelliatenuiflora)，該植物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，不僅耐鹽，耐寒，耐旱，而且耐堿性也較強(qiáng)，多生長(zhǎng)在草甸，鹽漬化土壤地區(qū)，一般在土壤含鹽量達(dá)到>5%以上，PH值大于10及10以上，仍能生長(zhǎng)良好。星星草還具有結(jié)實(shí)多，種子發(fā)芽率高，富含大量的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和礦質(zhì)元素等特點(diǎn)，是一種改良鹽堿化土壤的先鋒植物。硼是高等植物所必須的一種微量元素，在土壤中以多種形式存在，除了以分子和離子形式存在外，大多數(shù)以無機(jī)和有機(jī)形式存在。如果土壤中的硼元素不足，則會(huì)造成缺硼現(xiàn)象，如果硼元素過量，則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。植物硼的缺乏量，適用量和毒害量之間的濃度范圍一般很小，相對(duì)于缺硼現(xiàn)象，硼毒害現(xiàn)象更為常見。據(jù)調(diào)查，在我國(guó)吉林，遼寧，西藏和青海等地區(qū)的植物硼毒害現(xiàn)象較為嚴(yán)重，引起了廣泛的關(guān)注。關(guān)于緩解硼毒害的方法，大部分是添加其他元素如硅、磷等，而用H2S緩解硼毒害的方法則較少使用。

20世紀(jì)90年代左右，首次證明H2S是一種神經(jīng)活性物質(zhì)，從此人們開始加強(qiáng)對(duì)其生理功能的研究。Bressanra等研究結(jié)果表明，當(dāng)植物置于較高的硫素環(huán)境時(shí)，會(huì)產(chǎn)生H2S，并揭示H2S參與植物的生理過程。據(jù)報(bào)道，H2S可以緩解銅毒害下種子的萌發(fā)，而且可以保護(hù)在滲透脅迫下植物免受氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)以星星草為對(duì)象，研究H2S對(duì)硼毒害下星星草幼苗體內(nèi)SOD、POD活性的影響，旨在為緩解硼毒害嚴(yán)重地區(qū)植物的生長(zhǎng)受阻問題提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以NaHS作為H2S供體，既可以保證H2S分子的含量，又可以起到穩(wěn)定pH值的作用。

二、材料與方法

(一)材料

1.實(shí)驗(yàn)材料

星星草幼苗

2.儀器與實(shí)驗(yàn)用具

天平(電子分析天平，ACCULAB)、廣口瓶、氣泵、玻璃培養(yǎng)平皿、微量移液器、研缽等。

3.試劑

1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，用硼酸配成250 mg/L的硼溶液，配制200 μmol/L NaHS溶液等。

(二)實(shí)驗(yàn)步驟

1. 星星草培養(yǎng)與處理

(1)培育受試植物

星星草幼苗是在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下培育所得，用土培法在育苗盤中培養(yǎng)，每日按時(shí)噴灑營(yíng)養(yǎng)液，30天后可用。

(2)植物培養(yǎng)方法：水培法

用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行植物培養(yǎng)。容器為1 L的廣口瓶，具蓋子。塞子有三個(gè)孔，中間的兩個(gè)大孔用來固定植物(孔的大小由植物大小來決定)，旁邊的孔用來通氣。待實(shí)驗(yàn)苗進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，選取長(zhǎng)勢(shì)一致，稱重統(tǒng)一在一定范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好的植株，用清水將根沖洗干凈，再用脫脂棉將植物固定于容器。

(3)外源物質(zhì)H2S供體硫氫化鈉溶液的配制

H2S濃度實(shí)驗(yàn)：使用 NaHS溶液作為H2S的供體。

處理液的配制：取一定量體積的10 mmol/LNaHS母液，用蒸餾水稀釋成濃度為200 μmol/L NaHS溶液。

(4)實(shí)驗(yàn)處理受試植物

4個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理都均有2個(gè)重復(fù)。

表1 不同處理下的星星草幼苗

2.抗氧化物酶活性的測(cè)定

(1)超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

方法：氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定

A：原理：超氧物歧化酶(SOD)是動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的一種清除超氧負(fù)離子的酶。

B：試劑：a.0.1 mol/L pH7.8磷酸鈉(NaHPO4-NaH2PO4)緩沖液(PBS)

b.50 mmol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液(用0.1 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液配制而成)

c.14.5 mm/L dl-甲硫氨酸(MW=149.21g)(用50 mmol/L pH7.8 PBS配制,用前配制，避光保存)

d.3 μmol/L EDTA(MW=292) (用50 mmol/L pH7.8 PBS配制,用前配制，避光保存)

e.2.25 mm/LNBT(MW=817.7)溶液(用50 mmol/L pH7.8 PBS配制,用前配制，避光保存)

f.60 μmol/L核黃素(MW=376.36)溶液(用50 mmol/L pH7.8 PBS配制,用前配制，避光保存)

C：酶活性測(cè)定

測(cè)定前在270 ml 14.5 mmol/L dl-甲硫氨酸(dl-蛋氨酸)中分別加入EDTA、NBT、核黃素溶液各10 ml，混勻，此為反應(yīng)混合液。

SOD活性單位是以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位，用紫外分光光度計(jì)在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，計(jì)算反應(yīng)被抑制的百分比。

D：酶活力計(jì)算公式

式中，SOD總活性以鮮重酶單位每克表示，Ack為光照對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積，mL；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量，mL；W為樣品鮮重，g。

(2)過氧化物酶(POD)活性測(cè)定

方法：愈創(chuàng)木酚法

A：原理：本實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚(鄰甲氧基苯酚)為供氫體，為測(cè)定POD的經(jīng)典方法。

B：試劑：30%過氧化氫、愈創(chuàng)木酚、100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、20 mmol/LKH2PO4、反應(yīng)混合液[100 mmol/L PH6.0磷酸緩沖液50 mL，混勻后保存在冰箱中。

C：酶活性測(cè)定

取3支試管，加入反應(yīng)混合液、KH2PO4溶液和相應(yīng)的酶液(如表2)，立即開啟秒表，然后于470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每1 min讀數(shù)一次(4 min)。

表2 紫外吸收法測(cè)定過氧化物酶活性配置表

D：酶活力計(jì)算公式

POD總活性[U·min-1g-1(FW)]=

式中：POD總活性以酶單位每克鮮重表示。其中 △470=ACK-AE

比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。

ACK——照光對(duì)照管的吸光度。

AE——樣品管的吸光度。

Vt——樣品液總體積，mL。

V1——測(cè)定時(shí)樣品用量，mL。

W——樣品鮮重，g。

三、結(jié)果與分析

(一)不同處理下星星草幼苗的長(zhǎng)勢(shì)情況

圖1 不同處理下星星草幼苗生長(zhǎng)狀況

由圖1可以看出，在200 μmol /L的H2S處理下，該組幼苗和對(duì)照組的星星草幼苗長(zhǎng)勢(shì)情況基本一致，而在250 mg/L 的硼毒害作用下，星星草幼苗長(zhǎng)勢(shì)出現(xiàn)枯萎，發(fā)黃現(xiàn)象，說明星星草明顯受到了硼毒害作用，當(dāng)用200 μmol /L的H2S和250 mg/L的硼共同處理星星草幼苗，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)雖不如對(duì)照組和200 μmol /L的H2S處理下的星星草幼苗，但也得到了一定的緩解作用。

(二) H2S對(duì)硼毒害下星星草幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

圖2 H2S對(duì)硼脅迫下星星草幼苗體內(nèi)SOD酶活性影響

由圖2可以看出，在適量的硼濃度條件下，星星草幼苗體內(nèi)的酶活性約為13.88555 U·g-1(FW)，當(dāng)用200 μmol/L的H2S處理后，星星草幼苗SOD活性為12.656 U·g-1(FW)，說明H2S對(duì)星星草幼苗體內(nèi)的SOD活性會(huì)有一定的影響，但差異不顯著；當(dāng)用高硼溶液處理星星草，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的SOD活性為21.9678 U·g-1(FW)，與空白對(duì)照組相比較，有顯著升高的趨勢(shì)，而當(dāng)用H2S緩解高硼毒害下的星星草幼苗，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的SOD活性為16.9595 U·g-1(FW)，與空白對(duì)照組相比較有顯著升高的趨勢(shì)，與僅在高硼毒害下的星星草幼苗相比較SOD活性有顯著降低的趨勢(shì)。

(三)H2S對(duì)硼毒害下星星草幼苗過氧化物酶(POD)活性的影響

圖3 H2S對(duì)硼毒害下星星草幼苗過氧化物酶(POD)活性的影響

由圖3可以看出，在適量的硼濃度條件下，星星草幼苗體內(nèi)的酶活性約為0.646 U·min-1g-1(FW)，當(dāng)用200 μmol/L的H2S處理后，星星草幼苗POD活性為0.663 U·min-1g-1(FW)，說明H2S對(duì)星星草幼苗體內(nèi)的POD活性會(huì)有一定的影響，但差異不顯著；當(dāng)用高硼溶液處理星星草，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的SOD活性為1.394 U·min-1g-1(FW)，與空白對(duì)照組相比較，有顯著升高的趨勢(shì)，而當(dāng)用H2S緩解高硼毒害下的星星草幼苗，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的POD活性為0.981 U·min-1g-1(FW)，與空白對(duì)照組相比較有升高的趨勢(shì)，但效果不顯著，與僅在高硼毒害下的星星草幼苗相比較POD活性有顯著降低的趨勢(shì)，效果也不顯著。

四、 結(jié)論與小結(jié)

一般認(rèn)為，重金屬對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響存在一個(gè)高濃度下的抑制效應(yīng)，硼作為化學(xué)性元素，也具有同樣的效應(yīng)。許多研究者認(rèn)為，植物在新陳代謝過程中，遭受逆境如干早、低溫、重金屬毒害、鹽害、強(qiáng)光輻射等脅迫以及植物的衰老都會(huì)造成氧傷害積累，不斷產(chǎn)生活性氧。SOD和POD是氧自由基傷害中非常重要的2種保護(hù)酶，一般情況下，SOD是植物體內(nèi)清除自由基的第一道防線，它能立即對(duì)脅迫做出反應(yīng)，合成表達(dá)增強(qiáng)，使O2-轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2與O2；POD可以將SOD產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，它們的主要功能就是能有效地清除掉植物體內(nèi)過多的超氧負(fù)離子，有效地阻止高濃度氧的累積，使植物能夠維持正常的發(fā)育和生長(zhǎng)。酶活性越高，就越能有效地起作用，植物也就越能抵抗逆境的脅迫。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2S對(duì)硼毒害下星星草幼苗體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性具有一定的影響。當(dāng)星星草幼苗在硼毒害處理下，體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，與空白對(duì)照組和H2S處理組的酶活性相比發(fā)生了顯著性的升高，因?yàn)槊富钚缘纳呤菫榱说挚古鸲竞ο履婢车拿{迫，而當(dāng)用H2S緩解硼毒害下的星星草，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)活性與硼毒害組的酶活性相比發(fā)生了顯著的降低，與空白對(duì)照組相比發(fā)生了顯著性的升高，說明H2S對(duì)硼毒害的星星草幼苗具有一定的緩解作用，但是酶活性仍高于對(duì)照組，還是處于硼脅迫的環(huán)境下；當(dāng)星星草幼苗在硼毒害處理下，過氧化物酶(POD)活性，與空白對(duì)照組和H2S處理組的酶活性相比發(fā)生了顯著性的升高，因?yàn)槊富钚缘纳呤菫榱说挚古鸲竞ο履婢车拿{迫，而當(dāng)用H2S緩解硼毒害下的星星草，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的過氧化物酶(POD)活性與硼毒害組的酶活性相比，雖有下降，但效果不顯著，與空白對(duì)照組相比酶活性雖有升高，但效果不顯著，可能是本實(shí)驗(yàn)的濃度還與最適濃度有一定差距。