劉國陽,唐 波,常 晨,華 濤,侯繼波,張道華*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014;3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS),是主要由豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)引起的一類傳染病。其中PCV可以分為PCV1型、PCV2型以及PCV3型,而PCV1型不致病,PCV2型具有致病性,PCV3型的致病性尚未有定論[1-3]。目前,PCV2型被認(rèn)為是引起PMWS的主要病原。PMWS以仔豬進(jìn)行性消瘦、淋巴結(jié)腫大、肝炎、腎炎、間質(zhì)性肺炎等癥狀為臨床特征,組織病理學(xué)表現(xiàn)為淋巴結(jié)肉芽腫性炎癥、巨噬細(xì)胞增生、部分臟器淋巴細(xì)胞浸潤等[4]。該病最早于1991年加拿大首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道[5-7]；之后Allen等[8-9]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PCV2與PMWS發(fā)病有相關(guān)性。國內(nèi)最早報(bào)道PMWS的是郎洪武等[10]，他們通過對(duì)臨床材料進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè),證明該病在我國是存在的。

一直以來,PMWS是困擾世界上許多養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)國家的重要豬傳染病之一,每年造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn),雖然PCV2是引起PMWS發(fā)病的主要病原,但單獨(dú)感染時(shí)并不能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。國內(nèi)外許多學(xué)者均已在PMWS臨床診斷中發(fā)現(xiàn),PPV與PCV2存在混合感染[11]。本研究對(duì)健康的斷奶仔豬人工感染PPV和PCV2兩種病毒,對(duì)仔豬感染后的臨床癥狀和組織病理學(xué)變化進(jìn)行了觀察,對(duì)其血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè),并對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離獲得的1株P(guān)PV和PCV2對(duì)仔豬的致病性進(jìn)行了評(píng)估，以期為PPV和PCV2協(xié)同致病模型及二聯(lián)疫苗的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PCV2 NJ株和PPV NJ株均由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離鑒定、保存；PCV2的滴度利用PK-15a細(xì)胞增殖可達(dá)106.5TCID50/mL；PPV NJ株的滴度利用ST細(xì)胞增殖可達(dá)107.0TCID50/mL。ST細(xì)胞和PK-15a細(xì)胞由國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心馴化、保存。DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司;PCV2 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購自武漢科前生物技術(shù)有限公司。

篩選PRV、PCV2、PRRSV、PPV抗體陰性,PPV、PCV2抗原陰性的45日齡仔豬,共計(jì)20頭,購自江蘇某農(nóng)戶。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

篩選20頭仔豬,隨機(jī)分為4組,分別為空白對(duì)照組5頭、PPV單獨(dú)感染組5頭、PCV2單獨(dú)感染組5頭、PPV和PCV2混合感染組5頭。4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部封閉隔離飼養(yǎng)。在45日齡時(shí),通過滴鼻和肌肉注射方式感染,其中PPV單獨(dú)感染組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL PPV NJ株；PCV2單獨(dú)感染組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL PCV2 NJ株；PPV和PCV2混合感染組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL PPV NJ株(共計(jì)3 mL)和1.5 mL PCV2 NJ株(共計(jì)3 mL)；空白對(duì)照組分別以滴鼻和肌肉注射方式各接種1.5 mL DMEM培養(yǎng)液。接種劑量PPV NJ株為3×106.0TCID50/頭,PCV2 NJ株為3×105.0TCID50/頭。

在攻毒前稱量每頭豬的體重,在攻毒后觀察記錄臨床癥狀和直腸溫度,并于攻毒后3、5、7、10、14、21、28 d采集血清，備用。在攻毒后28 d剖殺,稱量體重,觀察肺臟、脾臟、肝臟和淋巴結(jié)病變。

1.3 試驗(yàn)仔豬的組織病理學(xué)檢查

剖殺仔豬后,采集不同器官(心、肝、脾、肺、腎、扁桃體和淋巴結(jié)),取組織病變位置用10%福爾馬林固定；在24 h后取出固定的組織,用梯度乙醇脫水,用二甲苯透明,隨后進(jìn)行透蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色,最后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4 試驗(yàn)仔豬病毒血癥的檢測(cè)

參照PPV和PCV2分離株的基因序列設(shè)計(jì)引物(表1),根據(jù)DNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取PPV和PCV2病毒DNA,采用熒光定量PCR (qPCR)法檢測(cè)被攻毒仔豬的病毒血癥。反應(yīng)程序?yàn)?50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。同時(shí)設(shè)ddH2O為陰性對(duì)照,獲得循環(huán)閥值(Ct值),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算血清樣品中PCV2和PPV的核酸拷貝數(shù)[12],判斷被攻毒仔豬是否存在病毒血癥。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列

1.5 PCV2 ELISA抗體和PPV HI抗體效價(jià)的檢測(cè)

采用PCV2 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清IgG抗體,根據(jù)試劑盒說明書判定各組PCV2 ELSIA抗體之間的相互關(guān)系。PPV HI抗體檢測(cè):參照《中國獸藥典》2015版中的血清HI抗體檢測(cè)方法,以能夠抑制50%豚鼠紅細(xì)胞凝集的血清最高稀釋倍數(shù)以2為底的對(duì)數(shù)為血清PPV HI抗體效價(jià)[13]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用GraphPad PRISM軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)仔豬的體溫變化

在攻毒后,每日10：00定時(shí)測(cè)量試驗(yàn)仔豬的直腸溫度,結(jié)果顯示：PPV單獨(dú)感染組和空白組體溫?zé)o顯著差異；在攻毒后11、12 d，PCV2單獨(dú)感染組的仔豬體溫較PPV單獨(dú)感染組和空白組有明顯升高,而PPV和PCV2混合感染組的仔豬體溫升高早于PCV2單獨(dú)感染組,且持續(xù)時(shí)間更長(圖1)。上述結(jié)果表明,PPV和PCV2混合感染能夠引起仔豬更嚴(yán)重的體溫反應(yīng)。

圖1 試驗(yàn)豬肛腸溫度的變化

2.2 試驗(yàn)仔豬平均日增重的變化

在攻毒前和攻毒后剖殺時(shí)，分別稱量試驗(yàn)豬的體重,計(jì)算每組試驗(yàn)豬的日平均增重情況。結(jié)果顯示：PPV和PCV2混合感染組豬的平均日增重極顯著低于PPV單獨(dú)感染組和空白組(P<0.01),顯著低于PCV2單獨(dú)感染組(P<0.05);PCV2單獨(dú)感染組豬的平均日增重顯著低于PPV單獨(dú)感染組與空白組;PPV單獨(dú)感染組與空白組豬的平均日增重?zé)o顯著性差異(圖2)。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬后能夠?qū)е伦胸i生長緩慢,平均日增重下降。

圖柱中標(biāo)不同大寫字母表示在不同試驗(yàn)組間差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 試驗(yàn)仔豬臨床癥狀及剖檢變化觀察

攻毒后每日觀察試驗(yàn)豬的精神、采食及臨床變化。結(jié)果顯示：PPV和PCV2混合感染組和PCV2單獨(dú)感染組豬在攻毒后先后出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡、遲鈍、不愿移動(dòng)等臨床表現(xiàn),以混合感染組的臨床表現(xiàn)更加嚴(yán)重,持續(xù)時(shí)間更長；在攻毒后10 d混合感染組4/5的試驗(yàn)豬在四肢和腹部出現(xiàn)泛紅的斑點(diǎn)(圖3A、圖3D)；PPV單獨(dú)感染組和空白組無明顯臨床變化。

在攻毒后28 d剖殺試驗(yàn)仔豬,觀察統(tǒng)計(jì)各臟器的病理變化。結(jié)果顯示：PPV和PCV2混合感染組豬的肺臟水腫、顏色變淺，部分區(qū)域出現(xiàn)肉變且按壓無彈性(圖3B、圖3C)，脾臟有少量出血點(diǎn),邊緣有明顯的鋸齒狀梗死灶(圖3E)，且淋巴結(jié)輕微腫大(圖3F)；PCV2單獨(dú)感染組、PPV單獨(dú)感染組和空白組豬的各臟器無明顯眼觀變化。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬引起的臨床癥狀更加明顯,仔豬的發(fā)病程度更加嚴(yán)重,證明PPV和PCV2混合感染仔豬能夠增強(qiáng)PCV2引起的臨床癥狀,加重PMWS的發(fā)病程度。

2.4 試驗(yàn)仔豬組織病理學(xué)變化

在攻毒后28 d,剖殺試驗(yàn)仔豬,采集相關(guān)臟器固定，制備組織病理學(xué)切片,經(jīng)HE染色后觀察變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PPV單獨(dú)感染組和空白組試驗(yàn)豬無明顯組織病理變化。PCV2單獨(dú)感染組部分試驗(yàn)豬的肺臟和淋巴結(jié)出現(xiàn)與PPV和PCV2混合感染組豬相似的病理變化,但混合感染組的試驗(yàn)豬各臟器均有更加嚴(yán)重的組織病變,其中：肺臟肺泡壁增厚,肺泡上皮細(xì)胞增生,伴有少量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤,支氣管上皮細(xì)胞有壞死和脫落(圖4A)；脾臟細(xì)胞界限不清,紅髓區(qū)增生伴有大量壞死細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(圖4B)；肝臟肝細(xì)胞重度水樣變性,胞質(zhì)疏松呈空泡化(圖4C)；淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞減少,細(xì)胞核深染(圖4D)；扁桃體局部區(qū)域出現(xiàn)細(xì)胞核深染和淋巴細(xì)胞浸潤(圖4E)；心臟心肌細(xì)胞水樣變性,胞質(zhì)腫脹、疏松、淡染(圖4F)。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬的組織病理變化較單獨(dú)感染組和對(duì)照組更加嚴(yán)重,進(jìn)一步證明兩種病毒具有相互促進(jìn)感染的作用,能夠引起更加嚴(yán)重的臨床癥狀。

2.5 試驗(yàn)仔豬血清病毒含量的檢測(cè)

分別于攻毒后3、5、7、10、14、21、28 d，采集試驗(yàn)豬的血樣并分離,提取血清DNA,采用qPCR法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的PPV和PCV2病毒含量。PCV2病毒含量的檢測(cè)結(jié)果如圖5A所示：PPV和PCV2混合感染5 d后即可檢測(cè)到PCV2陽性；PCV2單獨(dú)感染組在攻毒后10 d可以檢測(cè)到PCV2陽性,但其含量顯著低于混合感染組(P<0.05),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；PPV單獨(dú)感染組和空白組未檢測(cè)到PCV2陽性。

圖3 各組試驗(yàn)豬大體眼觀變化

圖4 試驗(yàn)豬部分臟器組織病理學(xué)變化(HE染色,400×)

PPV病毒含量的檢測(cè)結(jié)果如圖5B所示：在攻毒后5 d,PPV單獨(dú)感染組和PPV+PCV2混合感染組均可檢測(cè)到PPV陽性,但混合感染組的PPV病毒含量顯著高于PPV單獨(dú)感染組(P<0.05)；PCV2單獨(dú)感染組和空白組未檢測(cè)到PPV陽性。上述結(jié)果表明,PPV和PCV2混合感染后,PPV能夠促進(jìn)PCV2在豬機(jī)體內(nèi)增殖,提高PCV2病毒的含量。

2.6 試驗(yàn)仔豬抗體檢測(cè)結(jié)果

采集攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)的仔豬血清,利用PCV2 ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清抗體,結(jié)果顯示:PPV單獨(dú)感染組和空白組在試驗(yàn)持續(xù)期內(nèi),PCV2 ELISA抗體均為陰性;PPV和PCV2混合感染組在攻毒后10 d抗體檢測(cè)全部呈陽性；PCV2單獨(dú)感染組攻毒后14 d抗體檢測(cè)呈陽性；攻毒后14、21、28 d,混合感染組的抗體水平顯著高于PCV2單獨(dú)感染組(P<0.05)(圖6A)。

*表示與PCV2單獨(dú)感染組相比差異顯著(P<0.05);**表示與PCV2單獨(dú)感染組相比差異極顯著(P<0.01);#表示與PPV單獨(dú)感染組相比差異顯著(P<0.05)。下圖同。

根據(jù)《中國獸藥典》中血清HI抗體檢測(cè)方法,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)采集的仔豬血清HI抗體,結(jié)果顯示：PCV2單獨(dú)感染組和空白組的PPV HI抗體始終保持陰性；PPV和PCV2混合感染組以及PPV單獨(dú)感染組在攻毒后7 d全部轉(zhuǎn)陽,并且在攻毒后14、21、28 d,混合感染組PPV HI抗體水平顯著高于PPV單獨(dú)感染組(P<0.05)(圖6B)。表明,PPV和PCV2混合感染仔豬后血清抗體水平較單獨(dú)感染組明顯升高, PPV和PCV2能夠相互促進(jìn),增強(qiáng)機(jī)體的抗體反應(yīng)。

圖6 試驗(yàn)豬血清的特異性抗體水平

3 討論

目前普遍認(rèn)為PCV2是引起PMWS的主要病原,但單獨(dú)采用PCV2人工感染斷奶潔凈仔豬很難復(fù)制出PMWS的典型癥狀。Ober等[14]研究證實(shí),PCV2與PPV、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬肺炎支原體等病毒混合感染時(shí),PMWS發(fā)病癥狀明顯,甚至能夠?qū)е螺^高的死亡率,但國內(nèi)關(guān)于兩種病毒混合感染致病性差異的報(bào)道較少。

本研究通過控制試驗(yàn)過程,使得各組動(dòng)物的感染試驗(yàn)在相同的環(huán)境下進(jìn)行,避免復(fù)雜的外界環(huán)境干擾,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確科學(xué)性。研究表明,PPV和PCV2混合感染豬表現(xiàn)出的臨床癥狀和組織病理學(xué)變化較單獨(dú)感染組更為嚴(yán)重,血清中病毒含量更高,發(fā)病程度更重,表明PPV和PCV2共同感染后強(qiáng)化了PCV2的致病性,這與國外的相關(guān)報(bào)道[15-18]一致。在共感染組中,所有試驗(yàn)豬在試驗(yàn)周期內(nèi)均出現(xiàn)了厭食、精神萎靡、消瘦等癥狀；在試驗(yàn)28 d結(jié)束時(shí),甚至有1頭共感染仔豬體重呈負(fù)增長,生長指標(biāo)受到嚴(yán)重影響。組織病理學(xué)切片結(jié)果同樣顯示,共感染組較單獨(dú)感染組出現(xiàn)更加明顯的組織病理學(xué)損傷,脾臟、肝臟、肺臟等組織器官中均有不同程度的病理變化；此外,淋巴組織切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)機(jī)體淋巴結(jié)出現(xiàn)嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞損失。這些說明PPV和PCV2共感染嚴(yán)重破壞了仔豬機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。

本試驗(yàn)通過對(duì)各組感染豬不同時(shí)間點(diǎn)的病毒含量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PPV和PCV2混合感染組病毒血癥出現(xiàn)的時(shí)間更早；qPCR結(jié)果顯示攻毒后5 d,即可檢測(cè)到血清抗原陽性,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均呈現(xiàn)陽性結(jié)果,與單獨(dú)感染組結(jié)果相比病毒含量更高,持續(xù)時(shí)間更長。這進(jìn)一步驗(yàn)證了前期的報(bào)道結(jié)果[19]。另外,通過間接ELISA法和血凝抑制試驗(yàn)法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的PCV2和PPV抗體水平，發(fā)現(xiàn)：在攻毒后7 d，混合感染組可檢測(cè)到PPV HI抗體陽性,而PCV2抗體在攻毒后10 d轉(zhuǎn)陽,且在攻毒后21 d達(dá)到峰值,在28 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稍微降低。這也證明了前期國外關(guān)于PPV在機(jī)體內(nèi)先于PCV2病毒復(fù)制,PPV和PCV2混合感染后PPV能夠促進(jìn)PCV2增殖的觀點(diǎn)[20-21]。同時(shí),抗體檢測(cè)結(jié)果也解釋了本研究中仔豬混合感染后PCV2病毒血癥更加嚴(yán)重、持續(xù)期更長的原因：PCV2抗體出現(xiàn)較晚,機(jī)體受到PCV2侵染后未能及時(shí)組織有效的病毒清除系統(tǒng)。

本研究闡明了實(shí)驗(yàn)室新分離的兩株P(guān)PV和PCV2混合感染協(xié)同致病性作用,各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均顯示兩種病毒共同感染的致病性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)感染,引起的臨床癥狀和病理變化更為嚴(yán)重,這可為后期更進(jìn)一步研究PPV和PCV2混合感染的機(jī)理和研制兩種病毒混合感染防控的二聯(lián)疫苗提供參考。