賴(lài)隆永，劉友霖，劉小龍，譚禮寧，吳昌標(biāo)，楊 慧，余勛信，楊守深，徐 磊,5*

(1.派生特(福州)生物科技有限公司，福建 福州 350500；2.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350303；3.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350007；4.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012；5.南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京 211102)

在抗生素大量使用的今天，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生的廣泛耐藥性以及由此造成的環(huán)境污染，已經(jīng)對(duì)人們的健康構(gòu)成了威脅[1]。因而尋找和開(kāi)發(fā)新一代抗菌藥物是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，豬源抗菌肽已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一[2]。目前已經(jīng)從豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了12種以上不同的豬源抗菌肽，包括，PR-39、PMAP-23和NK-lysin等，這些豬源抗菌肽對(duì)多種微生物有廣譜殺菌作用。其中，NK-lysin可以直接結(jié)合脂多糖的類(lèi)脂部分，可抗各種細(xì)菌、真菌如大腸桿菌、巨大型芽孢桿菌、乙酸鈣不動(dòng)桿菌等，甚至還可以溶解一些腫瘤細(xì)胞[3]。NK-lysin的抗微生物和溶解腫瘤活性被認(rèn)為是由于它具有脂質(zhì)作用，其兩親性與螺旋結(jié)構(gòu)在細(xì)胞膜上形成孔道，完整的二硫鍵對(duì)于其抗微生物活性是必需的[4]。

豬源抗菌肽NK-lysin是一種由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌肽[5]，已經(jīng)在多種生物體中鑒定出豬源抗菌肽NK-lysin相似物，其中一些生物體具有抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抗菌活性[6,7]。楊霞等[8]研究表明合成綿羊抗菌肽NK-lysin對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有抑制活性，在治療雛雞沙門(mén)氏菌攻毒的過(guò)程中能夠明顯降低死亡率，對(duì)雛雞心臟、肝臟、腎臟的病理?yè)p傷也明顯小于對(duì)照組。然而，豬源抗菌肽NK-lysin(78個(gè)殘基)的片段長(zhǎng)度使得化學(xué)合成或生物合成變得困難[9]。閆潔熙以哺乳動(dòng)物NK-lysin為模板進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)NK-lysin通過(guò)破壞癌細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性對(duì)包括耐藥癌細(xì)胞在內(nèi)的一系列癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的抗癌活性；同時(shí)，NK-lysin通過(guò)擾動(dòng)細(xì)菌外壁、干擾細(xì)胞質(zhì)膜并與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)DNA相結(jié)合的雙重作用機(jī)制發(fā)揮抗菌活性，能夠迅速并劑量依賴(lài)性地抑制和殺死革蘭氏陰性菌/革蘭氏陽(yáng)性菌[10]。

在抗生素使用日益嚴(yán)重的形勢(shì)下[11-13]，豬源抗菌肽的價(jià)值和前景顯而易見(jiàn)。然而豬源抗菌肽在小鼠體內(nèi)的抑菌效果尚不明確，在化學(xué)合成上出現(xiàn)了很多的問(wèn)題。本文以小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其腹腔注射豬源抗菌肽和大腸桿菌，觀察小鼠對(duì)大腸桿菌的免疫預(yù)防和治療效果，并PCR擴(kuò)增、測(cè)序得到豬源抗菌肽NK-lysin的基因序列，對(duì)豬源抗菌肽NK-lysin的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，加強(qiáng)了豬源抗菌肽的基礎(chǔ)性研究和生物學(xué)功能與作用機(jī)制等方面的研究，對(duì)開(kāi)發(fā)與利用豬源抗菌肽具有重要的意義。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

豬源抗菌肽，多肽含量不低于300 μg/mL，由派生特(福州)生物科技有限公司按照已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利[14]制備；大腸桿菌(ATCC 25922)由龍巖學(xué)院楊守深博士饋贈(zèng)；7日齡昆明小鼠，購(gòu)自吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 主要試劑

麥康凱培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、PCR 試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)、DL2000 DNA Maker(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限)、利福平(Sigma公司)等。

1.3 主要設(shè)備

離心機(jī)(冠森生物上海公司)、Thermo Hybaid px2 thermal cycler PCR儀(美國(guó)，Thermo Electron公司)、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)VerSa Doc2000(美國(guó)，Bio-Rad公司)等。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì)和合成 通過(guò)基因序列分析軟件和引物設(shè)計(jì)分析軟件DNAman 6.0和Primer Premier 5.0，參考公開(kāi)發(fā)表的豬源抗菌肽NK-lysin(Genbank: X85431.1)共保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物AMP-234F和AMP-234R，可以擴(kuò)增出234 bp的NK-lysin基因序列，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 豬源抗菌肽NK-lysin的引物信息

1.4.2 目的片段擴(kuò)增 取17～18周齡健康豬的新鮮小腸組織，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，-80 ℃保存或立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在20 μL體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，42 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，70 ℃ 15 min，4 ℃保存；將得到的產(chǎn)物再用引物AMP-234F和AMP-234R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物30 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因片段大小，與標(biāo)準(zhǔn)的DL2000 DNA Marker進(jìn)行比較，觀察是否擴(kuò)增出了234 bp的特異性片段。

1.4.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序 將經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定與預(yù)計(jì)相一致的片段長(zhǎng)度為234 bp的條帶切下，根據(jù)瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作步驟回收目的基因，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4.4 抗菌肽NK-lysin的生物信息學(xué)分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，通過(guò)DNAman軟件對(duì)豬源抗菌肽NK-lysin序列與NCBI登錄的豬、家禽、魚(yú)類(lèi)、綿羊和牛的NK-lysin序列進(jìn)行基因序列同源性比較并繪制遺傳關(guān)系圖譜；通過(guò)ProParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)其基本性質(zhì)進(jìn)行分析；通過(guò)SOPMA tool(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)PHD數(shù)據(jù)庫(kù)查找其3D結(jié)構(gòu)；通過(guò) String tool(https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=5RWaH208azBm&input_page_show_search=on)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析[15]。

1.4.5 大腸桿菌的培養(yǎng)和純化 將保存于-80 ℃的大腸桿菌菌株室溫解凍，取少量接種于麥康凱液體培養(yǎng)基中，于搖床150 r/min、37 ℃培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌接種環(huán)蘸取菌液，于麥康凱瓊脂平板表面劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌環(huán)挑取典型菌落，接種于10 mL液體麥康凱培養(yǎng)基中，于搖床150 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 藥物敏感性試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)按常規(guī)K-B法進(jìn)行，挑取分離培養(yǎng)的單個(gè)大腸桿菌典型菌落增菌后均勻涂布在麥康凱平板上，用無(wú)菌鑷子將含有豬源抗菌肽成分的自制紙片(浸泡用藥液體積比為豬源抗菌肽∶水=1∶9)和利福平紙片緊貼于瓊脂表面，用無(wú)菌水制成的紙片做對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)，置37 ℃恒溫箱內(nèi)18 h后，觀察結(jié)果。

1.4.7 大腸桿菌半數(shù)致死量(Median Lethal Dose，LD50)測(cè)定 大腸桿菌用液體麥康凱培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，冰箱保存?zhèn)溆?。隨機(jī)選取試驗(yàn)小鼠90只，分為6組，6個(gè)攻毒組濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/mL，腹腔注射攻毒，0.2 mL/只。接種后觀察各組試驗(yàn)小鼠的呼吸、精神、采食、飲水、糞便等臨床情況。觀察24 h，記錄死亡情況，計(jì)算大腸桿菌的LD50。

1.4.8 抗菌肽對(duì)小鼠感染大腸桿菌的預(yù)防作用 試驗(yàn)動(dòng)物在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)前飼喂1周(飼料中不含任何抗生素)，使其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境，確定健康后方可進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)1.4.7測(cè)定結(jié)果確定菌液濃度，分組結(jié)果見(jiàn)表2。預(yù)防組每只小鼠腹腔注射0.2 mL豬源抗菌肽，細(xì)菌模型組注射等量生理鹽水；24 h后，預(yù)防組和細(xì)菌模型組每組以LD50腹腔注射大腸桿菌菌液0.2 mL/只，攻毒后，觀察各組試驗(yàn)小鼠的呼吸、精神、采食、飲水、糞便等臨床情況。治療組以LD50腹腔注射大腸桿菌菌液0.2 mL/只，觀察各組試驗(yàn)小鼠的呼吸、精神、采食、飲水、糞便等臨床情況，12 h后每只小鼠腹腔注射0.2 mL豬源抗菌肽。

表2 試驗(yàn)分組及給藥

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽NK-lysin的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

將由豬小腸組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增，得到大小為234 bp的目的基因條帶(見(jiàn)圖1)，與預(yù)計(jì)期望得到的擴(kuò)增目的基因條帶片段大小相一致。

2.2 抗菌肽NK-lysin的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 抗菌肽NK-lysin序列同源性分析 將經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定與預(yù)計(jì)相一致的條帶切下，回收目的基因，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)DNAman軟件對(duì)豬源抗菌肽NK-lysin序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)得的豬源抗菌肽NK-lysin序列與雞、白鯇、羅非魚(yú)、花鱸和野生日本鳴鶉等物種NK-lysin序列同源性均很低，存在較大的差異，與綿羊和牛的同源性均為69.66%；然而和NCBI登錄的豬源抗菌肽的同源性達(dá)97.78%(表3)。經(jīng)過(guò)對(duì)其他物種的NK-lysin進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的分析，從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，該豬源抗菌肽與NCBI登錄的豬源抗菌肽保持高度同源；同時(shí)與家畜綿羊、牛分屬于同一分支，而與其他物種有很大變異(圖3)。

2.2.2 抗菌肽NK-lysin基本性質(zhì)分析 通過(guò)ProParam tool分析可知，豬源抗菌肽NK-lysin預(yù)測(cè)的分子量是8834.68，包含78個(gè)氨基酸，其中賴(lài)氨酸含量最高，達(dá)到14.1%，其次是異亮氨酸，為12.8%。該蛋白的分子式為C380H664N112O109S9，理論等電點(diǎn)達(dá)到9.47，是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為36.01。豬源抗菌肽NK-lysin預(yù)計(jì)的半衰期在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞(體外)為30 h，在酵母(體內(nèi))中為20 h，在大腸桿菌中(體內(nèi))大于10 h。

2.2.3 抗菌肽NK-lysin二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)SOPMA tool預(yù)測(cè)可知，豬源抗菌肽NK-lysin二級(jí)結(jié)構(gòu)為：α螺旋區(qū)域56個(gè)氨基酸，占71.79%；延伸鏈有7個(gè)氨基酸，占8.97%；β轉(zhuǎn)角區(qū)域有6個(gè)氨基酸，占7.69%；無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域有9個(gè)氨基酸，占11.54%。

通過(guò)PHD數(shù)據(jù)庫(kù)查找，得到其3D結(jié)構(gòu)模型圖(圖4)。

M：DL2000 Marker；1：豬小腸組織；+：陽(yáng)性對(duì)照；-：陰性對(duì)照

圖2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

表3 豬源抗菌肽NK-lysin序列與NCBI登錄的NK-lysin序列的同源性

圖3 豬源抗菌肽NK-lysin的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.2.4 抗菌肽NK-lysin互作網(wǎng)絡(luò)分析 通過(guò)String tool進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，表明豬源抗菌肽NK-lysin可以與4個(gè)蛋白發(fā)生相互作用，分別是IL-2、GZMB、ENSSSCG00000024337和SRRT(圖5)。而其中的ENSSSCG00000024337和SRRT為非特征性蛋白。

圖4 豬源抗菌肽NK-lysin的3D結(jié)構(gòu)模型

圖5 豬源抗菌肽NK-lysin互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

豬源抗菌肽對(duì)大腸桿菌的體外抑制作用見(jiàn)表4。由表4可知，豬源抗菌肽和利福平對(duì)大腸桿菌都具有抑菌作用，但是豬源抗菌肽的抑菌圈直徑比利福平大，抑菌作用比利福平的抑菌作用強(qiáng)。

表4 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 LD50的確定

小鼠人工感染大腸桿菌4 h后，各組試驗(yàn)小鼠出現(xiàn)不同程度大腸桿菌感染癥狀，如精神沉郁、采食和飲水減少、腹瀉等臨床情況。各組小鼠死亡多發(fā)生在24～36 h。各組試驗(yàn)小鼠的死亡情況見(jiàn)表5。通過(guò)公式，計(jì)算得到大腸桿菌的LD50=1.0×105.75cfu/mL，選用這個(gè)濃度為攻毒濃度，劑量為0.2 mL/只。

2.5 抗菌肽預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.4測(cè)定結(jié)果確定菌液濃度，預(yù)防組每只小鼠腹腔注射0.2 mL豬源抗菌肽；24 h后，預(yù)防組和細(xì)菌組，每組以1.0×105.75cfu/mL腹腔注射大腸桿菌菌液，攻毒后，細(xì)菌模型組陸續(xù)出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，如精神沉郁、采食和飲水減少、腹瀉等臨床情況，直至死亡；而預(yù)防組起初少部分出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，但后期出現(xiàn)恢復(fù)，最終的預(yù)防組存活率(80.00%)高于細(xì)菌模型組(46.67%)。而治療組在腹腔注射大腸桿菌菌液后陸續(xù)出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，在其死亡前，即12 h，腹腔注射豬源抗菌肽，存活率達(dá)到了86.67%。各組試驗(yàn)小鼠的存活情況見(jiàn)表6。

表5 各組試驗(yàn)小鼠的死亡情況

表6 各組試驗(yàn)小鼠的存活情況

3 討論

試驗(yàn)通過(guò)提取豬小腸組織RNA、PCR擴(kuò)增和測(cè)序得到豬源抗菌肽序列。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽與NCBI登錄的豬源抗菌肽同源性很高，而與其他物種的同源性很低。雞源和牛蛙抗菌肽NK-lysin的生物學(xué)功能已經(jīng)明確，并有對(duì)其基本性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[16-17]。王鵬等發(fā)現(xiàn)牛蛙抗菌肽粗提物具有穩(wěn)定的生物學(xué)活性，能夠減緩蛋雞產(chǎn)蛋性能的衰退，并能夠提高蛋雞的蛋品質(zhì)與免疫力[18]。對(duì)豬源抗菌肽NK-lysin的生物信息學(xué)分析具有重要意義，也可為豬源抗菌肽NK-lysin的生物學(xué)功能研究提供參考。通過(guò)ProParam tool分析發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽在大腸桿菌中(體內(nèi))的半衰期大于10 h，遠(yuǎn)長(zhǎng)于其他來(lái)源抗菌肽的半衰期，這很可能與其具有抑菌作用有重要聯(lián)系，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)理提供了方向。

GZMB是外源性的絲氨酸蛋白酶，來(lái)自細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)和自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer Cell，NK)釋放的細(xì)胞漿顆粒。有研究表明GZMB破壞了細(xì)菌的中間代謝和蛋白質(zhì)合成，從而促成免疫細(xì)胞的死亡計(jì)劃[19]。而IL-2是一種白介素，是免疫系統(tǒng)中的一類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能調(diào)控免疫系統(tǒng)中白血球的細(xì)胞活性，促進(jìn)Th細(xì)胞(Helper T cell)和CTL的增殖，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。有研究表明IL-2明顯延長(zhǎng)結(jié)核桿菌H37RV株感染小鼠和豚鼠的半數(shù)死亡時(shí)間，降低死亡率，減少感染動(dòng)物脾、肺組織內(nèi)的結(jié)核桿菌數(shù)[20]。通過(guò)String tool進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽NK-lysin與IL-2和GZMb發(fā)生相互作用，因此很有可能是豬源抗菌肽NK-lysin激活了相關(guān)通路，使得IL-2和GZMb的表達(dá)量上調(diào)，提高機(jī)體免疫力，破壞細(xì)菌的生長(zhǎng)和合成，從而起到抑菌的作用。

利福平為利福霉素類(lèi)半合成廣譜抗菌藥，對(duì)多種病原微生物均有抗菌活性。陳社生[21]應(yīng)用利福平治療人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病，發(fā)現(xiàn)利福平可溶性粉劑對(duì)細(xì)菌性疾病有很好的療效，在生產(chǎn)上值得推廣應(yīng)用。因此，本文選擇利福平作為參照，發(fā)現(xiàn)豬源抗菌肽的抑菌圈比利福平大，抑菌作用強(qiáng)。另外，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題應(yīng)引起注意，長(zhǎng)期使用某一藥物很容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致救治無(wú)效，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。本研究結(jié)果對(duì)開(kāi)發(fā)新一代的抗菌藥物抗菌肽意義重大。

豬源抗菌肽NK-lysin最初是從豬的脾臟、骨髓和大腸中分離到，該基因編碼的多肽與人顆粒溶素(Granulysin，GNLY)具有相似結(jié)構(gòu)和抗菌特性，對(duì)細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、腫瘤細(xì)胞等具有廣泛抑制殺滅活性[22-23]，其將成為抗生素的代替品，從而減少抗生素的使用。然而，對(duì)于豬源抗菌肽的研究?jī)H僅停留在體外的抑菌試驗(yàn)，其在動(dòng)物體內(nèi)的抑菌效果尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)：腹腔注射豬源抗菌肽的預(yù)防組小鼠，具有較強(qiáng)的大腸桿菌抵抗力，存活率達(dá)到80.00%；治療組在腹腔注射大腸桿菌菌液后陸續(xù)出現(xiàn)大腸桿菌感染癥狀，在其死亡前，即12 h，腹腔注射豬源抗菌肽，存活率達(dá)到了86.67%。說(shuō)明豬源抗菌肽對(duì)大腸桿菌病具有預(yù)防和治療效果。