王海彬 董志軍 郭立濤 石晶 董微麗

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北 承德 067000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的一種嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，是造成患者失明的主要原因之一〔1〕。DR的病變范圍包括黃斑水腫，玻璃體腔出血與視網(wǎng)膜新生血管性青光眼，嚴(yán)重影響患者的視力。視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞不可逆凋亡是DR發(fā)病的直接原因。研究表明，糖尿病因高血糖激活機(jī)體的信號(hào)通路，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧增加，導(dǎo)致患者視網(wǎng)膜組織損傷與神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔2〕。枸杞多糖為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.干燥成熟果實(shí)枸杞子的活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)神經(jīng)、增強(qiáng)免疫等藥理作用〔3～7〕。研究表明，枸杞多糖能夠抑制糖尿病視網(wǎng)膜血管新生、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，從而減輕線粒體病理性變化，阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜病變具有一定療效〔8～10〕。目前對(duì)枸杞多糖保護(hù)視網(wǎng)膜的作用機(jī)制尚未明確，對(duì)此，本研究通過觀察枸杞多糖對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況、視網(wǎng)膜含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、Bcl-2、Bax mRNA與蛋白表達(dá)的影響，探討枸杞多糖對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 2月齡清潔級(jí)雄性健康SD大鼠60只，體重(180±20)g，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(冀)2013-0026，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。

1.2藥物 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma 公司)，枸杞多糖(寧夏潤德枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司)，葡萄糖測(cè)定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)，caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA與蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)，細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)試劑盒(美國Roche公司)。

1.3儀器 血糖儀(美國Roche 公司)，熒光定量PCR 儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及糖尿病大鼠模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)方法〔11〕建立STZ糖尿病模型，大鼠禁食12 h后腹腔注射STZ 60 mg/kg。72 h后，取尾靜脈血測(cè)血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型成功標(biāo)準(zhǔn)〔12〕。取造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、枸杞多糖低、中、高劑量組，未造模大鼠作為對(duì)照組，每組12只。枸杞多糖低、中、高濃度組大鼠分別灌胃給予50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg枸杞多糖干預(yù)，對(duì)照組與模型組大鼠給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥12 w。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 各組大鼠處死后取眼球，置于多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，采用二甲苯30 min透明，置于石蠟中包埋，采用連續(xù)切片，切片厚4 μm。脫蠟后，蘇木素染色3 min，沖洗后，采用1%鹽酸酒精分化2 s，自來水沖洗，分別至于梯度乙醇脫水，伊紅染色2 min，95%酒精分色，無水酒精脫水，二甲苯15 min透明，中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡 取大鼠眼球石蠟切片，對(duì)切片進(jìn)行TUNEL染色，60℃恒溫烤片120 min，脫蠟后，Proteinase K工作液37℃消化處理30 min，加入TUNEL反應(yīng)混合物50 μl孵育處理60 min，過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑37℃孵育處理30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯15 min透明，中性樹膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的陽性細(xì)胞核呈棕褐色。計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，AI=陽性細(xì)胞數(shù)/神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)。

1.7RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平 取各組大鼠眼球，剝離視網(wǎng)膜，采用TRIzol法抽提總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增cDNA。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s。caspase-3、Bcl-2、Bax引物序列：caspase-3上游5′-AATTCAAGGGACGGGTCATG-3′，下游5′-GCTTGTGCGCGTACAGTTTC-3′(164 bp)；Bcl-2上游5′-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3′，下游5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′(255 bp)；Bax上游5′-TGGAGCTGCAGAGGATGATT-3′，下游5′-CAGGGCCTTGAGCACCACTT-3′(231 bp)；內(nèi)參β-actin上游5′-CCTGCTTGCTGATCCACA-3′，下游5′-CTGACCGAGCGTGGCTAC-3′(115 bp)。采用瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，分別記錄caspase-3、Bcl-2、Bax及相應(yīng)β-actin的光密度值(A)，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)。

1.8Western印跡法檢測(cè)視網(wǎng)膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取各組大鼠眼球，剝離視網(wǎng)膜組織。對(duì)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞總蛋白進(jìn)行RIPA裂解提取，并進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，變性，上樣，電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)抗體(1%脫脂奶粉稀釋作為一抗和二抗，一抗效價(jià)比1：300，二抗效價(jià)比1∶1 000)。Ipwin 32圖像分析軟件分析，測(cè)定波長為450 nm，分別計(jì)算caspase-3、Bcl-2、Bax條帶與β-actin條帶的灰度比值，以caspase-3/β-actin、Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin比值代表相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜膜盤結(jié)構(gòu)清晰，各層細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠視網(wǎng)膜部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫，層次模糊，排列稀疏紊亂，膜盤間隙出現(xiàn)空泡樣，核染色質(zhì)密集，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞豐富；枸杞多糖低、中、高濃度組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫與模型組比較減輕，細(xì)胞層次清晰，排列整齊，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，高濃度組大鼠視網(wǎng)膜改善情況顯著優(yōu)于中、低濃度組。見圖1。

圖1 各組視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400)

2.2各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組視網(wǎng)膜未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞；模型組視網(wǎng)膜大量細(xì)胞呈棕褐色，細(xì)胞AI明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；枸杞多糖低濃度組視網(wǎng)膜發(fā)現(xiàn)部分陽性細(xì)胞；枸杞多糖中、高濃度組視網(wǎng)膜陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞AI明顯低于模型組(P<0.05)。枸杞多糖中、高濃度組視網(wǎng)膜細(xì)胞AI明顯低于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)；枸杞多糖高濃度組大鼠視網(wǎng)膜陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于枸杞多糖中濃度組(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3各組視網(wǎng)膜caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組視網(wǎng)膜caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平均明顯升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，枸杞多糖低、中、高濃度組caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2/Bax明顯上調(diào)(P<0.05)。枸杞多糖高、中濃度組caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平顯著低于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平及Bcl-2/Bax顯著高于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)。見表1。

圖2 各組視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果(×400)

組別nAIcaspase-3Bcl-2BaxBcl-2/Bax對(duì)照組120.021±0.0050.125±0.0170.779±0.1040.306±0.0332.546±0.435模型組80.206±0.0861)0.630±0.0521)0.317±0.0591)0.711±0.1121)0.446±0.0331)枸杞含糖低濃度組100.187±0.0230.459±0.0642)0.557±0.0562)0.652±0.1062)0.854±0.1161)枸杞含糖中濃度組120.089±0.0242)3)0.300±0.0312)3)0.648±0.0822)3)0.490±0.0642)3)1.322±0.1352)3)枸杞含糖高濃度組120.063±0.0102)4)0.268±0.0442)3)0.712±0.0992)3)0.383±0.0372)3)1.859±0.1412)3)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與枸杞多糖低濃度組比較：3)P<0.05；枸杞多糖中濃度組比較：4)P<0.05；下表同

2.4各組視網(wǎng)膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組視網(wǎng)膜caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平、Bcl-2/Bax明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，枸杞多糖低、中、高濃度組caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2/Bax顯著上調(diào)(P<0.05)。枸杞多糖高、中濃度組caspase-3和Bax蛋白表達(dá)較枸杞多糖低濃度組明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax明顯高于枸杞多糖低濃度組(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組視網(wǎng)膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平

1～5：對(duì)照組、模型組、枸杞多糖低濃度組、枸杞多糖中濃度組、枸杞多糖高濃度組圖3 各組視網(wǎng)膜caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

3 討 論

隨著糖尿病的發(fā)病率不斷提高，DR作為糖尿病最常見并發(fā)癥之一，是引起人類致盲的眼病，其發(fā)病率也伴隨著糖尿病發(fā)病率的增高不斷上升〔13〕。DR主要發(fā)生機(jī)制包括多元醇通路激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增加、蛋白激酶(PK)C激活與氮基己糖四條經(jīng)典通路途徑，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔14〕。Caspase-3是Caspase家族目前已知的最重要的凋亡執(zhí)行蛋白〔15〕。Bcl-2與Bax在視網(wǎng)膜病變神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程中起重要作用，Bcl-2是目前已知的最強(qiáng)凋亡抑制因子，具有阻礙促凋亡基因信號(hào)傳遞的作用，Bax則屬于促凋亡因子，二者形成異源二聚體Bcl-2/Bax抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax降低時(shí)更容易導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)細(xì)胞死亡〔16〕。

枸杞子性甘味平，歸肝腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精抗衰、潤肺明目、強(qiáng)筋健骨的功效，枸杞多糖為枸杞子的主要活性成分。藥理學(xué)研究表明，枸杞多糖能夠提高機(jī)體超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化因子表達(dá)，降低機(jī)體丙二醛(MDA)含量水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力及清除氧化產(chǎn)物的能力，防止氧化應(yīng)激損傷胰島細(xì)胞并促進(jìn)其再生，起降糖作用〔17〕。枸杞多糖對(duì)DR具有改善作用，能夠通過延遲整流鉀電流的幅度防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并且可通過拮抗糖基化終產(chǎn)物的增殖毒性，降低視網(wǎng)膜細(xì)胞因子的表達(dá)，減少細(xì)胞損傷〔18，19〕。通過本研究病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變導(dǎo)致細(xì)胞水腫、膜盤間隙增大等，并且會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。枸杞多糖具有改善視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。枸杞多糖通過降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜caspase-3、Bax mRNA與蛋白的表達(dá)水平，提高凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2/Bax，防止視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這可能是枸杞多糖對(duì)DR的保護(hù)作用機(jī)制。