吳瓊，王明月，呂岱竹，林冰，陳健

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，?？?571101；2.農(nóng)業(yè)部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(?？?，?？?571101；3.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海口 571101)

紫皮豇豆(Vignaunguiculatassp. Cylindrica)，蔓生，豆科一年生草本植物，因莢的顏色為紫紅色而得名，耐熱，適合夏季種植[1，2]。研究顯示：紫皮豇豆內(nèi)富含維生素、脂肪、膳食纖維、微量元素和植物蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，所含多酚類物質(zhì)具有超強的抗氧化能力[3]，有助于人體抵御癌癥、心血管疾病及與機體衰老相關(guān)的疾病，是優(yōu)良的保健蔬菜，具有較高的保健價值[4]。目前，發(fā)達國家普遍通過脫水、冷凍等方式對其進行加工，貯藏量與加工量已經(jīng)占到所產(chǎn)蔬菜總量的80%。另外，因其具有質(zhì)地脆嫩、含水量不高的特征，適宜進行腌制加工，腌制生產(chǎn)在我國比較普遍。紫皮豇豆是現(xiàn)代家庭、餐館、航海和軍隊等理想的常備美味、健康食品。

測定植物總多酚的方法有很多，有高錳酸鉀滴定法、色譜法及光譜法等[5-11]。其中，高錳酸鉀滴定法是較為傳統(tǒng)的檢測方法，利用高錳酸鉀的強氧化性與被測物中的還原性物質(zhì)作用，此方法的選擇性低、誤差大。常用的色譜法有高效液相色譜法(UV、DAD)、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法(質(zhì)譜-選擇離子監(jiān)測法)、液相色譜-質(zhì)譜法等，色譜法所用儀器價格昂貴，而且需要大量的標準品定性、定量，成本較高，僅適用于單體成分的檢測。光譜分析測定法是基于顯色反應測定樣品中的多酚含量，常用的方法有可見光分光光度測定法、酒石酸亞鐵分光光度法、福林-酚比色法等[12，13]。本試驗選用福林-酚比色法測定紫皮豇豆中的多酚含量，該方法具有成本低、操作簡單等優(yōu)點。

目前對紫皮豇豆營養(yǎng)物質(zhì)的研究主要停留在常規(guī)的營養(yǎng)物質(zhì)上，如蛋白質(zhì)、淀粉和維生素等[14，15]，而真正具有食療保健作用的功能性營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是具有降糖活性的功能性營養(yǎng)物質(zhì)報道較少。張紅梅等發(fā)現(xiàn)紫紅豇豆中花青素的總量明顯高于綠豇豆和白豇豆[16]；隋華嵩等研究發(fā)現(xiàn)，紫皮豇豆中的紫紅色素水溶性良好，并測定了紫皮豇豆豆莢與種子紫紅色素的紫外最大吸收波長[17]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)對紫皮豇豆中具有降糖活性成分的相關(guān)研究。本試驗采用溶劑提取法提取紫皮豇豆中的多酚，再利用福林-酚比色法測定紫皮豇豆中的總多酚含量，最后利用體外降糖試驗評價紫皮豇豆多酚的抗α-葡萄糖苷酶活性，為進一步開發(fā)紫皮豇豆中的天然、有效且無毒副作用的功能性營養(yǎng)成分，輔助治療糖尿病提供了試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫皮豇豆：?？谑校惺?，新鮮。

沒食子酸標準品：純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司；福林酚試劑、無水碳酸鈉：均為分析純；丙酮：色譜純；α-葡萄糖苷酶：100 U，上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷：pNPG，上海源葉生物科技有限公司；KH2PO4、K2HPO4：廣州化學試劑廠。

1.2 主要儀器設備

Synergy 2多功能微孔板檢測儀；晶安石英96孔酶標板；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；CR22N高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器有限公司；電子天平、移液槍以及其他實驗室常用儀器設備。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制和樣品的制備

稱取0.04 g沒食子酸標準品，用高純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為400 μg/mL的沒食子酸標準溶液；稱取0.01 g阿卡波糖標準品，用高純水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為100 μg/mL的阿卡波糖母液，稀釋可得1 μg/mL阿卡波糖標準溶液。

稱取50 g紫皮豇豆樣品，加入盛有500 mL(固液比1∶10)80%丙酮水溶液的裝有蛇形冷凝管的圓底燒瓶中，置于50 ℃水浴中提取5 h，在此過程中需震搖2～3 次，待提取液冷卻后過濾，過濾物再重復提取2次。合并濾液，在 45 ℃下于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去丙酮，剩余溶液經(jīng)過冷凍干燥得到多酚提取物2.32 g，分取0.1 g紫皮豇豆多酚提取物于10 mL容量瓶中加水溶解后定容，制成紫皮豇豆多酚提取液，備用。

1.3.2 樣品中總多酚含量的測定

1.3.2.1 標準曲線的繪制

取5支10 mL容量瓶，分別加入0，0.05，0.1，0.25，0.4，0.6 mL沒食子酸標準溶液，加入4 mL蒸餾水，混勻后加入0.5 mL福林酚試劑，大約30 s后再加入4 mL 8%碳酸鈉溶液，再用高純水定容至10 mL，室溫下反應30 min后，在740 nm下掃描，以沒食子酸質(zhì)量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2.2 樣品的測定

吸取0.3 mL紫皮豇豆多酚提取液和沒食子酸標準溶液分別置于10 mL容量瓶中，按1.3.2.1方法反應后上機，計算樣品中總多酚的含量。

1.3.3 多酚提取物降糖活性試驗

在96孔板中分別加入0.5 mL多酚提取液和阿卡波糖標準溶液，再分別加入0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶及67 mmol/L pH 6.9的磷酸鉀緩沖液各20 μL，37 ℃預保溫15 min后，加入20 μL 6 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷，在37 ℃酶解15 min，加80 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應，每個處理分別做4個重復，在415 nm波長下測定吸光值。

1.3.4 方法評價

1.3.4.1 重復性

取5支容量瓶，分別吸取0.3 mL同一批次提取的紫皮豇豆多酚提取液，按照1.3.2.1條件反應后測其吸光度，計算相對標準偏差。

1.3.4.2 加標回收率

取6支10 mL容量瓶，分別加入0.2 mL多酚提取液，再分別加入0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.25 mL 的400 μg/mL沒食子酸標準溶液，按1.3.2.1條件反應后測其吸光度，測定沒食子酸的回收率，計算結(jié)果的相對標準偏差。

1.3.4.3 抑制率曲線的繪制

將阿卡波糖標準溶液和多酚提取液分別稀釋2，10，50，250，1250倍，按1.3.3條件反應后測定吸光度，繪制多酚提取液抑制率曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測波長的確定

將紫皮豇豆多酚提取液與沒食子酸標準溶液用福林-酚比色法，在400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描，測定吸光度，掃描結(jié)果見圖1。

圖1 紫皮豇豆多酚和沒食子酸的光譜吸收譜圖Fig.1 Spectral absorption spectra of polyphenols of Vigna unguiculata and gallic acids

由圖1可知，提取液與標準溶液的光譜曲線輪廓相同，可以選用沒食子酸作為標準品對紫皮豇豆的總多酚進行定量，兩者的最大吸收峰都在740 nm處，因此選擇740 nm作為最佳檢測波長。

2.2 樣品總多酚含量的測定

圖2 標準曲線Fig.2 Standard curve

以沒食子酸量(μg)為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線，沒食子酸標準溶液在0～240 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。線性方程為：Y=0.0027X+0.083 ，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9933，其中Y為吸光度，X為沒食子酸量。

測量樣品中的多酚含量，見公式(1)：

(1)

式中：Xi為樣品中總多酚含量(mg/100 g)；Ai為提取液吸光度；m為紫皮豇豆樣品的質(zhì)量(g)；M1為提取物凍干后的質(zhì)量(g)；M2為分取的紫皮豇豆提取物質(zhì)量(g)；V1為提取液上機液體積(mL)；V2為分取的紫皮豇豆提取物定容體積(mL)。

通過上述公式計算可得紫皮豇豆中總多酚的含量是614 mg/100 g。

2.3 方法評價

2.3.1 重復性實驗

測定5組同一批次的紫皮豇豆多酚含量分別為596，643，589，648，595 mg/100 g，相對標準偏差(RSD)為3.7%，說明該方法具有較高的精密度。

2.3.2 加標回收實驗

表1 總多酚含量測定方法的加標回收率Table 1 Recovery rates of determination method for total polyphenol content

由表1可知，在0～100 μg添加水平，方法的回收率為92.6%～116.0%，相對標準偏差小于10%，說明該方法準確可靠，可用于紫皮豇豆總多酚的測定。

2.4 提取液降糖活性的測定

樣品抑制率按公式(2)計算：

酶活性抑制率(%)=[1-(Abs1-Abs2)/Abs0]×100。

(2)

式中：Abs1是樣品組的吸光度；Abs2是不加酶組的吸光度；Abs0是不加樣品組的吸光度。

通過上述公式計算可得紫皮豇豆多酚提取液的抑制率為100.5%，阿卡波糖為99.2%。

提取液和阿卡波糖標準溶液稀釋后的抑制率見表2。

表2 稀釋后提取液和阿卡波糖的抑制率Table 2 Inhibitory rates of diluted extract and acarbose

阿卡波糖作為已知的α-葡萄糖苷酶抑制劑，可減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，其作用原理是競爭性地與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，從而使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢。按照1.3.4.3的方法，平行測定阿卡波糖及提取液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

圖3 酶活性抑制曲線Fig.3 Inhibitory curves of enzyme activity

由圖3可知，提取液與阿卡波糖抑制曲線有相同的變化趨勢，抑制率與相對濃度呈對數(shù)關(guān)系，隨著相對濃度不斷上升，對α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷增加，當相對濃度為0.1時，提取液與阿卡波糖抑制曲線均出現(xiàn)拐點，繼續(xù)減少相對濃度，抑制率變化趨勢放緩，進入平臺期。阿卡波糖的抑制曲線方程為y=11.039In(x)+63.65，R2=0.8691；提取液的抑制曲線方程為y=12.762In(x)+113.24，R2=0.8805。經(jīng)計算阿卡波糖的IC50為0.29 μg/mL，而紫皮豇豆提取液的IC50與阿卡波糖相近，為0.34 μg/mL。由此，可以推論紫皮豇豆多酚降糖原理與阿卡波糖相似，可以與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，達到抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。

3 結(jié)論

以沒食子酸為對照品，建立了福林-酚比色法測定紫皮豇豆中總多酚的方法。結(jié)果表明，在0～240 μg沒食子酸量與吸光度呈良好的線性關(guān)系，測定值為614 mg/100 g，平均加標回收率為103.6%，相對標準偏差為9.6%，該方法具有良好的選擇性和靈敏度，適用于檢測紫皮豇豆中總多酚的含量，也為不同作物中多酚含量的檢測提供了依據(jù)和參考。另外，試驗發(fā)現(xiàn)紫皮豇豆多酚提取物對α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制作用，抑制率接近相同濃度的陽性對照阿卡波糖，說明紫皮豇豆多酚對α-葡萄糖苷酶具有體外降糖活性。紫皮豇豆多酚是一種潛在的具有天然降糖活性的功能性營養(yǎng)食品，可用于輔助治療糖尿病，值得進一步開發(fā)利用。