李煒,王娟毅,姚忠強(qiáng),賀啟華,吳光輝

胃癌是目前已知的主要消化道惡性腫瘤之一[1]。胃癌早期無(wú)明顯臨床癥狀，早期診斷率較低，同時(shí)由于該疾病發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移的時(shí)間早，當(dāng)患者被確診時(shí)已錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，因此胃癌預(yù)后差、病死率較高[2]。近年來(lái)研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA)在調(diào)控癌癥的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[3-4]。miR-494是miRNAs家族中重要的一員，段鴻芳等[5]研究表明：miR-494在肝癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腦部腫瘤等疾病中呈現(xiàn)不同的差異表達(dá)，并且可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。李新華等[6]研究表明：miR-494在彌漫型胃癌組織中的表達(dá)下降了4.39倍，在腸型胃癌組織中則下降了2.50倍。目前有較多的miR-494表達(dá)量與胃腸道腫瘤的研究，但miR-494對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響的機(jī)制研究較少。本文旨在研究miR-494在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移的影響，以期了解miR-494在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移作用機(jī)理，從而為胃癌的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集及主要細(xì)胞

34例胃癌病人腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本均來(lái)自2015年6月至2017年8月于我院接受胃癌手術(shù)的患者。人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器

TRAIL購(gòu)自英國(guó)Pepro Tech公司；Ki67抗體購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司；VEGF、Vimentin抗體購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；N-cadherin、E-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自廣州威佳科技有限公司；青霉素鈉購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自默沙克有限公司；磷酸緩沖液PBS購(gòu)自天津科密歐有限公司。

低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分組干預(yù) 將人胃癌SGC-7901細(xì)胞分為三組，分別為空白對(duì)照組(Control)、空白質(zhì)粒導(dǎo)入組(miR-NC)和目的基因組(miR-494)；其中空白對(duì)照組不做任何處理，空白質(zhì)粒導(dǎo)入組導(dǎo)入切除目的基因的質(zhì)粒，目的基因組導(dǎo)入目的基因miR-494。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基中，放入溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞傳三代培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書方法操作，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 RT-PCR 用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，按照試劑盒操作方法檢測(cè)各RNA表達(dá)水平，本實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。

1.3.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況 取上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96個(gè)孔板中細(xì)胞接種，每孔接種1.5×106個(gè)細(xì)胞。放入溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞貼壁后，分別培養(yǎng)0、1、2、3 d后加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光度值，計(jì)算胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率。

1.3.5 Transwell檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲性及遷移性 使用移液器在Transwell小室的PVPF聚碳酸濾膜外表面均勻涂抹5 μg 纖粘連蛋白，膜內(nèi)側(cè)表面涂5 μg matrigel。調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞至2×105個(gè)/孔，接種于transwell小室，在37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)4 h。建立細(xì)胞侵襲模型，使用PBS清洗三次并去除小室中膜內(nèi)側(cè)表面多余的細(xì)胞，多聚甲醛進(jìn)行固定；400倍顯微視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野，倒置顯微鏡下采用雙盲計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)膜下表面的細(xì)胞數(shù)均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)三次。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基保存于滅菌離心管中。使用1 200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細(xì)胞，置于冰中裂解30 min，再次以1 200 r/min離心10 min，加入200 μL的Loading Buffer 緩沖液，100 ℃煮沸10 min；使用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，使用SDS-PAGE電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后放入TBST溶液中緩慢搖動(dòng)洗膜5 min，再將 PVDF膜放入配制好的一抗液中孵育，室溫下?lián)u動(dòng)30 min后放入4 ℃恒溫箱中過(guò)夜。取出后使用TBST洗滌三遍后放入二抗反應(yīng)液中室溫孵育2 h；封閉液：二抗為2 000∶1；曝光后以Actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用的軟件為SPSS 22.0和GraphPda Prism5，方差分析使用單因素方差分析，當(dāng)組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用SNK-q方法進(jìn)行進(jìn)一步的比較；使用單因素方差分析時(shí)，若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中miR-494的表達(dá)水平

由圖1(A)可以看出，相比癌旁正常組織，胃癌組織miR-494的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；由圖1(B)可以看出，相比空白對(duì)照組，空白質(zhì)粒導(dǎo)入組miR-494的表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)；相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組miR-494的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

2.2 胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果

由圖2(A、B)可以看出，相比空白對(duì)照組，空白質(zhì)粒導(dǎo)入組Ki67的表達(dá)水平無(wú)顯著變化(P>0.05)；相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組Ki67的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；由圖2(C)可以看出，相比空白對(duì)照組，空白質(zhì)粒導(dǎo)入組細(xì)胞抑制率無(wú)顯著變化(P>0.05)；相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組細(xì)胞抑制率顯著升高(P<0.05)。

2.3 胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲性檢測(cè)結(jié)果

由圖3可以看出，相比空白對(duì)照組，空白質(zhì)粒導(dǎo)入組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目無(wú)顯著變化(P>0.05)；相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著降低(P<0.05)。

圖1不同組織中miR-494的表達(dá)水平 A：癌旁組織和胃癌組織中miR-494的表達(dá)水平；B：miR-494的相對(duì)表達(dá)水平。與正常組織相比，**P<0.05

圖2胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 A：Ki67蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)印記圖；B：Ki67蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量；C：細(xì)胞抑制率。與miR-NC組相比，**P<0.05

圖3胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲性檢測(cè)結(jié)果 A：transwell小室檢結(jié)晶紫染色測(cè)結(jié)果圖；B：?jiǎn)挝幻娣e細(xì)胞侵襲數(shù)目。與miR-NC組相比，**P<0.05

2.4 蛋白質(zhì)印記檢測(cè)相關(guān)蛋白結(jié)果

由圖4可以看出，相比空白對(duì)照組，空白質(zhì)粒導(dǎo)入組Vimentin、VEGF、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)；相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組VEGF、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

圖4蛋白質(zhì)印記檢測(cè)相關(guān)蛋白結(jié)果 A：蛋白質(zhì)印記圖；B：蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。與miR-NC組相比，**P<0.05

3 討論

miR-494位于染色體14q32.31上的mi-RNA[7]。目前段鴻芳等[8]研究證明：其表達(dá)水平與肝癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腦部腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等密切相關(guān)，且在不同的腫瘤組織中表達(dá)不同。本研究發(fā)現(xiàn)相比癌旁正常組織，胃癌組織細(xì)胞中的miR-494表達(dá)水平顯著降低，李新華等[9]研究表明：miR-494在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織中的表達(dá)，與本研究得出的結(jié)論相一致。

增殖細(xì)胞周期相關(guān)核抗原(Ki67)所編碼的基因位于10號(hào)染色體上，其分子量為345 kd，是一種細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，其表達(dá)水平反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo)同時(shí)這種基因在維持結(jié)構(gòu)方面起著重要作[10]。馬志君等[11]研究表明：Ki67的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期重要組成部分。在胃癌SGC-7901細(xì)胞中Ki67的表達(dá)量高說(shuō)明胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖速度快，反之當(dāng)胃癌SGC-7901細(xì)胞中Ki67表達(dá)量低說(shuō)明胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)：相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組Ki67的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明miR-494的高表達(dá)可以降低Ki67的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖。楊慶龍[12]等研究表明，降低Ki67的表達(dá)水平，可以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，與本研究得出的結(jié)論相一致。

細(xì)胞的侵襲和遷移受到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchyml transition，EMT)的調(diào)節(jié)[13]。EMT是指上皮細(xì)胞能暫時(shí)喪失細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞移動(dòng)能力。腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞極性喪失，改變自身細(xì)胞形態(tài)與其他細(xì)胞分離[14-15]；N-鈣粘蛋白(N-cadherin，CDH2)也被稱為鈣黏著蛋白-2或神經(jīng)鈣粘著蛋白，是人體由CDH2基因編碼的蛋白質(zhì)。N-鈣粘蛋白是在多種組織中表達(dá)并起到介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘附的功能的跨膜蛋白。付麗梅等[16]研究表明：N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率與癌的浸潤(rùn)深度、分化程度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且隨著癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生N-cadherin蛋白表達(dá)量會(huì)顯著增加。當(dāng)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖受到抑制時(shí)，VEGF表達(dá)則會(huì)降低，E-cadherin表達(dá)水平降低、Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平說(shuō)明胃癌SGC-7901細(xì)胞的EMT過(guò)程受到抑制，同時(shí)其黏附能力增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)能力減弱。唐瑩等[17]研究表明：Vimentin是一種間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的骨架蛋白，在維持間質(zhì)細(xì)胞的特性中這種蛋白起關(guān)鍵的作用。其研究也表明Vimentin表達(dá)出現(xiàn)異常時(shí)，細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)成也會(huì)發(fā)生顯著的改變，這種改變會(huì)導(dǎo)致正常的上皮細(xì)胞變成纖維狀且易于游動(dòng)遷移，使得細(xì)胞的侵襲、遷移能力增強(qiáng)。EMT晚期時(shí)Vimentin表達(dá)量通常會(huì)顯著強(qiáng)加，這也是EMT晚期的顯著標(biāo)志之一[18-19]。胃癌SGC-7901細(xì)胞中Vimentin高表達(dá)量意味著細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)間的黏附能力降低，癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力受到抑制。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，相比空白質(zhì)粒導(dǎo)入組，目的基因組VEGF、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低，Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明miR-494可以通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程使得胃癌SGC-7901細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力減弱，同時(shí)N-鈣粘蛋白也表明細(xì)胞質(zhì)間的黏附能力增加，其運(yùn)動(dòng)能力減弱。韓亮等[20]研究表明：通過(guò)抑制細(xì)胞EMT過(guò)程及降低相關(guān)蛋白E-cadherin蛋白表達(dá)水平，升高Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)水平可以有效降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖及侵襲能力，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，miR-494的表達(dá)可以有效降低胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。其作用機(jī)制可能與抑制相關(guān)增殖蛋白Ki67并調(diào)節(jié)EMT過(guò)程有關(guān)。但調(diào)控胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的相關(guān)蛋白及信號(hào)通路較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討miR-494的表達(dá)通過(guò)信號(hào)通路的對(duì)胃癌SGC-7901的增殖、侵襲及遷移能力影響機(jī)制。