魯晴 譚海濤 賀錦橋 楊心妮張鑫 黎靜

1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院廣西數(shù)字醫(yī)學(xué)3D打印臨床研究中心，廣西貴港 537100

骨質(zhì)疏松是中老年人的一大常見疾病，以低骨量，骨顯微組織損壞為主要特征，易引起老年人骨折，致殘甚至死亡[1]。成骨細(xì)胞的主要功能是負(fù)責(zé)骨的形成，分泌與礦化，其特異性分泌的多種生物活性物質(zhì),可以調(diào)節(jié)骨的形成和重建過程[2]。其功能隨著衰老的過程而發(fā)生顯著的變化[3]。乳鼠顱蓋骨由于含有骨膜和骨松質(zhì)，具有良好的表達(dá)成骨細(xì)胞蛋白合成以及繁殖的能力，培養(yǎng)條件較為簡單，因而被普遍選作體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的組織來源[4]。該試驗(yàn)旨在運(yùn)用酶消化法和組織塊相結(jié)合的培養(yǎng)法獲取原代成骨細(xì)胞，并采用D-半乳糖法構(gòu)建成骨細(xì)胞衰老模型，為后續(xù)對成骨細(xì)胞衰老機(jī)制的探討打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)特

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生5～7 d的昆明乳鼠，雌雄均可，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑

MEM α培養(yǎng)基，膠原酶Ⅱ型，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒，PBS，胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），β-半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色試劑盒，D-(+)半乳糖，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，riboFECT CP Transfection Kit。

2 方法

2.1 提取細(xì)胞

取5只新生5～7 d昆明乳鼠，剝離顱骨的頂骨和額骨，剔除骨片上附著的多余血液和結(jié)締組織。隨后將骨片置于含0.25%EDTA胰酶的離心管中浸沒，37℃消化10 min。取適量培養(yǎng)基中和胰酶。將骨碎塊加至0.1%Ⅱ型膠原酶中，37℃水浴箱消化30 min。棄上清液，將骨碎片置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中平鋪，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱倒置干涸培育。約2～4 h后翻正培養(yǎng)瓶，加入4 mL MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d后換液。

2.2 成骨細(xì)胞傳代和純化

骨組織塊爬出的細(xì)胞生長鋪至培養(yǎng)瓶80%滿時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。經(jīng)胰酶消化后，加入MEM完全培養(yǎng)基終止消化，取細(xì)胞懸液靜置3min，棄掉沉淀的骨組織塊。上清液離心1 000 rpm×5 min。棄上清液后重新加入MEM完全培養(yǎng)基重懸均勻細(xì)胞，加入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。運(yùn)用差速黏附法[4]分離混雜其中的成纖維細(xì)胞：即把培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞懸液在細(xì)胞孵箱中靜置15 min，吸取上清液至新培養(yǎng)瓶內(nèi)，再靜置15 min，如此連續(xù)轉(zhuǎn)瓶2～3次，成纖維細(xì)胞便可去除。

2.3 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

每天用倒置相差顯微鏡察看原代培育，傳代細(xì)胞的爬出以及生長狀況，察看細(xì)胞狀態(tài)并拍照記錄。

2.4 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色

顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)第三代生長狀態(tài)良好的原代細(xì)胞，將細(xì)胞接種于六孔板。待細(xì)胞生長至80%后，按照試劑盒說明書進(jìn)行堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察染色情況，顯微鏡下挑選細(xì)胞散布均勻的視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。

2.5 D-半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老

將生長狀態(tài)良好的小鼠成骨細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞生長至50%左右，D-半乳糖處理組更換為含有D-半乳糖MEM培養(yǎng)基 （20 g/L），對照組給予無D-gal培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

2.6 β-半乳糖苷酶染色

六孔板內(nèi)原代成骨細(xì)胞長到70%，按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒進(jìn)行操作，并在顯微鏡下各組隨機(jī)挑選并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率（%）。

2.7 RT-PCR法檢測BMP2、ALP基因表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采取RT-PCR法檢測各組基因表達(dá)程度(引物信息見表1）。每個(gè)樣本重復(fù)測量3次，以GAPDH為基因內(nèi)參參照標(biāo)準(zhǔn)，按照2^－△△Ct計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較分析。 組間比較（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

骨塊貼壁2 d后有細(xì)胞自骨碎片爬出，貼壁逐漸展開（如圖1A)。3 d左右細(xì)胞數(shù)量顯著增多，以骨塊為中心向周圍放射狀生長，呈梭形，三角形，非規(guī)則鱗片形(如圖1B）。4 d左右生長的細(xì)胞基本鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶（如圖 1C）。

圖1 不同天數(shù)細(xì)胞爬出骨片狀況 （×100)

3.2 堿性磷酸酶染色結(jié)果

體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞能夠合成大量堿性磷酸酶，分析結(jié)果表明，分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)染色后呈現(xiàn)明顯的深藍(lán)色和藍(lán)黑色，其中陽性細(xì)胞所占比例約為90%，見圖 2。

3.3 β-半乳糖苷酶染色結(jié)果

經(jīng)β-半乳糖苷酶染色后觀察可發(fā)現(xiàn)，衰老陽性細(xì)胞顯現(xiàn)出藍(lán)綠色，陰性細(xì)胞無著色。結(jié)果表明，與對照組相比，D-半乳糖處理組陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.01），如圖 3。

圖2 原代細(xì)胞堿性磷酸酶染色觀察（A:×4 B:×100）

圖3 成骨細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色情況分析

3.4 RT-PCR分析>BMP2、ALPmRNA表達(dá)

如圖4結(jié)果顯示，D-半乳糖誘導(dǎo)48 h后成骨細(xì)胞中基因BMP2、ALPmRNA表達(dá)較對照組表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖4 成骨細(xì)胞基因BMP2及ALP表達(dá)變化（±s）

4 討論

骨質(zhì)疏松以骨量減低，骨脆性加重，骨密度減少為主要特征。成骨細(xì)胞是參與骨重塑的主要細(xì)胞之一[5]，原代培養(yǎng)是其體外培養(yǎng)主要細(xì)胞來源之一[6]。由于新生乳鼠的頂骨和額骨能夠產(chǎn)生較多成骨細(xì)胞且附著的成纖維細(xì)胞較少[7]，因此選擇其顱骨進(jìn)行取材保證成骨細(xì)胞的增殖數(shù)量與純度。該實(shí)驗(yàn)使用酶化法與組織塊法聯(lián)合進(jìn)行原代成骨細(xì)胞的培育。此方法不但提取成骨細(xì)胞成功率較高，易于實(shí)驗(yàn)操作，且取得的成骨細(xì)胞數(shù)量多。

對成骨細(xì)胞進(jìn)行生物形態(tài)學(xué)特征的觀察，是對其鑒別的常用方法之一[8]。該實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則梭形，三角形，鱗片形，有多個(gè)長短不一的細(xì)胞突起，細(xì)胞核卵圓形位于胞質(zhì)中央，符合其他文獻(xiàn)報(bào)道的成骨細(xì)胞特性[9]。此外，堿性磷酸酶（ALP）的高表達(dá)被廣泛看作是成骨細(xì)胞早期分化的重要指標(biāo)[10]，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)90%的細(xì)胞都被堿性磷酸酶染色，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞分泌堿性磷酸酶，符合其他文獻(xiàn)報(bào)道[4]的成骨細(xì)胞的生物學(xué)特征。

D-半乳糖是一種正常生理性營養(yǎng)成分，能在機(jī)體內(nèi)通過酶解轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟菫闄C(jī)體生命活動(dòng)提供能量，但是過量的D-半乳糖會導(dǎo)致機(jī)體代謝異常，并引起機(jī)體生理功能發(fā)生顯著變化[11]。因此，D-半乳糖建立的動(dòng)物衰老模型已經(jīng)被國內(nèi)外認(rèn)可并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的多方領(lǐng)域。X-Gal在細(xì)胞衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會產(chǎn)生深藍(lán)色產(chǎn)物。堿性磷酸酶（ALP）是成骨細(xì)胞通過基質(zhì)小泡釋放的參與鈣磷代謝的一種重要酶，能夠加速細(xì)胞的成熟、鈣化，ALP活性加強(qiáng)會加速骨基質(zhì)礦化形成，因此ALP活性表達(dá)被看作是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化程度和功能狀態(tài)的重要指標(biāo)[12]。RUNx轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族中的RUNx2是成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，也稱骨形態(tài)發(fā)生蛋白，具備誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化成骨細(xì)胞的作用[13]。該實(shí)驗(yàn)原代成骨細(xì)胞經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)4后，β-半乳糖苷酶染色發(fā)現(xiàn)其陽性率明顯增加，而且D-半乳糖處理后成骨細(xì)胞ALP、RUNxmRNA均呈低表達(dá)，提示D-半乳糖誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，增殖分化能力削弱，細(xì)胞呈衰老表現(xiàn)。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)通過Ⅱ型膠原酶消化聯(lián)合組織塊培養(yǎng)建立了原代小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，并通過D-半乳糖誘導(dǎo)法建立了小鼠成骨細(xì)胞衰老模型，為后續(xù)對成骨細(xì)胞衰老機(jī)制以及老年骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。