范素菊 李嘉 李森 楊興東

摘要：為制備金剛烷胺（AMD）的單克隆抗體（mAb），改造AMD的半抗原，采用EDC/NHS法合成人工免疫原AMD-BSA和檢測抗原AMD-OVA，經(jīng)紫外掃描和凝膠電泳進行鑒定，AMD與載體蛋白[牛血清白蛋白（BSA）、雞卵白蛋白（OVA）]成功偶聯(lián);用被免疫原（AMD-BSA）免疫BALBC/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，獲得AMD雜交瘤細胞株，腹腔注射小鼠后，得到抗AMD的mAb。小鼠免疫后的多抗血清的效價均在6.4×103以上，所制得的雜交瘤細胞上清液的效價為3.6×102～1.0×103，2D5細胞株的腹水效價為5.12×105，對AMD的IC50值為1.02 μg/L，除與金剛乙胺的交叉反應率為9.82%，與其他結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應性。表明獲得了高價、敏感和特異的抗AMD的單克隆抗體，為進一步的免疫學快速檢測提供了技術支持。

關鍵詞：金剛烷胺;免疫原;單克隆抗體;ELISA;抗體制備;抗體鑒定

中圖分類號： S852.4+3

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）15-0220-04

金剛烷胺（amantadine，AMD）是一種穩(wěn)定、無色、結(jié)晶的胺，具有特殊的對稱性結(jié)構(gòu)。由于其具有干擾M2流感病毒蛋白合成和抗膽堿的作用[1]，臨床上用作抗帕金森病毒和抗病毒藥物[2-3];在動物飼養(yǎng)中，AMD主要用于治療和預防禽流感和豬的傳染性胃腸炎[4-5]。但是，AMD的過度使用會對人類和環(huán)境產(chǎn)生不利的生態(tài)后果。首先，它的廣泛使用可以增加細菌耐藥菌株的發(fā)生[6-8]。其次，AMD的殘留物可能通過食物鏈進入人體。AMD在人體內(nèi)蓄積6周以上可以引起惡心、頭暈、失眠、心慌等影響[9]。事實上，美國食品和藥物管理局已經(jīng)禁止在牲畜中使用AMD;2005年，中國原農(nóng)業(yè)部（公告號：560）禁止AMD作為家禽的抗病毒獸藥。然而，由于其低廉的價格和可用性，家禽業(yè)中AMD仍然作為A型禽流感的治療藥在非法使用[6]。因此，已經(jīng)建立了許多分析方法以檢測AMD的殘留。

代謝研究結(jié)果表明，AMD在體內(nèi)以原型形式存在并在體內(nèi)積聚[10]。目前，AMD檢測方法包括液相色譜法[11-12]、熒光液相色譜法[13]、高效液相色譜法[14-15]、毛細管區(qū)帶電泳法[16]、選擇性和熒光分光光度法[17]、氣相色譜法[18]、毛細管氣體色譜法[19]、五氟苯甲酰氯萃取衍生化氣相色譜法[20]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21]。雖然這些方法準確而敏感，但這些色譜方法需要昂貴的設備、繁雜的預處理、技術熟練的操作人員，因此，它們不適合AMD的現(xiàn)場篩查?？梢?，在動物源性食品中開發(fā)直觀、靈敏、高效的AMD檢測分析方法至關重要。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）[22]和膠體金免疫層析測定[23]代表快速、特異、方便和高度敏感的方法，適用于分析大量樣品。在這項研究中，制備了一種針對AMD的新型單克隆抗體，為今后的免疫學快速檢測提供技術上的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金剛烷胺、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、羥琥珀亞酰胺（NHS）、弗氏佐劑，Sigma公司產(chǎn)品;羊抗鼠酶標二抗，洛陽華美生物工程有限公司;其他試劑均為AR級。SPF級雌性BABLC/c小鼠購自鄭州大學實驗動物中心，由周口師范學院神經(jīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗動物中心飼養(yǎng)。

儀器設備：Thermo Scientific NanoDrop 2000c紫外分光光度計，Thermo Electron;Multiskan FC型酶標儀，上海賽默飛世爾儀器有限公司;LHS-450恒溫培養(yǎng)箱，鄭州生元儀器有限公司;AR224CN電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件，上海天能科技股份有限公司;DYY-6D型電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司;90-2定時恒溫雙向磁力攪拌器，上海精科實業(yè)有限公司;HCJ-4A數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州市金壇區(qū)指前鎮(zhèn)旭日實驗儀器廠;SW-CJ-2G型超凈工作臺，蘇州凈華儀器有限公司;3701型二氧化碳培養(yǎng)箱，USA Precision公司。

1.2 方法

1.2.1 AMD免疫原的合成及鑒定 參考Xu等報道的方法進行AMD免疫原的合成[22]。80 mg AMD充分溶解在 3 mL 的甲苯和一定量的二碳酸二叔丁酯溶液中，然后加入105 mg 6-溴乙酸乙酯，在氮氣保護下升溫至128 ℃充分回流2 d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的產(chǎn)物調(diào)節(jié)pH值至10，然后調(diào)節(jié)pH值為1，干燥濃縮后得含有羧基的AMD半抗原（圖1-A）。取 12 mg AMD半抗原，加入3 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，依次加入11 mg NHS，17 mg EDC，冰浴條件下攪拌反應18 h，得到A液;30 mg牛血清白蛋白（BSA）加入3 mL PBS溶液中（B液）。將A液慢速滴加到B液中，室溫下反應1 d;放入透析袋中用PBS緩沖液透析3 d，制得AMD免疫原，其反應路線見圖1-B。利用紫外掃描和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[24]來判斷AMD和載體蛋白是否成功偶聯(lián)。

1.2.2 動物免疫 用70 mg免疫原（AMD-BSA）和等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，背部皮下多點注射到3只小鼠，間隔18 d之后用同樣的劑量與弗氏不完全佐劑乳化后，對BABLC/c小鼠進行免疫，先后共免疫5次;免疫結(jié)束后，小鼠尾靜脈采血，得到抗AMD多克隆抗體血清（polyclonal antibody serum，pAbs），并進行鑒定。

1.2.3 單克隆抗體制備 利用融合劑PEG4000，將免疫最優(yōu)小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0按一定比例混合，并加入GNK溶液和HAT培養(yǎng)基，然后將混合液按0.1 m/孔加入到鋪有飼養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)板中，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）篩選陽性孔，有限稀釋法對篩選到的陽性孔進行亞克隆，得到抗AMD的雜交瘤細胞株，將細胞株注入到經(jīng)液體石蠟處理過的小鼠腹腔中，以此來制備抗AMD mAbs。

1.2.4 AMD mAbs的鑒定

1.2.4.1 抗AMD mAbs效價測定 間接ELISA檢測抗AMD mAbs效價[25]：檢測抗原（AMD-OVA）包被在ELISA板內(nèi);依次加入倍比稀釋的AMD mAbs、酶標二抗和顯色液，每步孵育一定時間后均用PBST洗板;加入終止液后，放入酶標儀進行測定。

1.2.4.2 抗AMD mAbs敏感性測定 間接競爭ELISA檢測mAbs對AMD的半數(shù)抑制濃度（IC50），以此來鑒定其敏感性。其操作過程與間接ELISA的區(qū)別在于包板后，每孔加入D450 nm值為1.0左右的mAbs和倍比稀釋的AMD標準品。

1.2.4.3 AMD mAbs特異性測定 依據(jù)交叉反應（cross reaction，CR）試驗鑒定AMD的特異性。用間接競爭ELISA測定金剛乙胺、金剛烷、1-金剛烷羧酸、利巴韋林、嗎啉胍、阿昔洛韋、呋喃唑酮等類似物的IC50值。CR=（金剛烷胺IC50值/其他化合物IC50值）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMD免疫原的鑒定結(jié)果

圖2顯示，BSA的吸收峰（10 mm）在280 nm的位置，AMD的吸收峰在412 nm的位置，AMD-BSA的吸收峰（10 mm）與BSA的吸收峰相比發(fā)生了向右偏移，表明半抗原AMD與BSA已經(jīng)聯(lián)結(jié)。BSA的泳動速率略大于AMD-BSA的泳動速率（圖3），分析物分子質(zhì)量的大小與泳動速率成反比，由此可知BSA與AMD成功聯(lián)結(jié)。

2.2 AMD pAbs的效價、敏感性鑒定結(jié)果

免疫原（AMD-BSA）免疫的1號和2號BABLC/c小鼠的pAbs效價都達到6.4×103以上，2號小鼠達到1.28×104（圖4），表明AMD pAbs效價較高，免疫原（AMD-BSA）的免疫原性優(yōu)良。3只被免小鼠的mAbs均有抑制的產(chǎn)生，其中以3號被免小鼠的抑制最優(yōu)（圖5），以AMD的稀釋濃度的對數(shù)值為橫坐標，標準品測定值/不加標準品測定值（B/B0）為縱坐標作圖，線性回歸方程：y=-0.406 1x+1.008 6，r2=0991 6，由此方程推算出AMD的IC50值為17.88 μg/L，進一步表明mAbs具有較高的敏感性。

2.2 AMD mAbs的鑒定結(jié)果

2.2.1 效價測定結(jié)果 利用ELISA篩選出4株雜交瘤細胞穩(wěn)定分泌的AMD mAbs，其效價較高，其中2D5細胞株的上清液效價最優(yōu)，用此株誘生抗AMD的腹水，效價為2.15×105（表1）。

2.2.2 敏感性界定結(jié)果 間接競爭LEISA測定細胞株的AMD mAbs的回歸方程為y=-0.311 6x+0.502 4（r2=0.990 3）（圖6），2D5對AMD的IC50為1.02 μg/L，進一步表明本研究所制得的mAbs對AMD的敏感性較好。

2.2.3 AMD mAbs的特異性鑒定結(jié)果 AMD mAbs與金剛乙胺的CR為9.82%，與金剛烷、1-金剛烷羧酸、利巴韋林、嗎啉胍、阿昔洛韋、呋喃唑酮等類似物沒有CR（表2），進一步表明AMD mAbs特異性較強。

3 討論與結(jié)論

高質(zhì)量的抗原是制備優(yōu)質(zhì)抗體的基礎。根據(jù)文獻報道，Xu等首先利用二碳酸二叔丁酯保護AMD上的氨基，然后使用6-溴乙酸乙酯在AMD上引入活性基團[—（CH2）5COOH]， 運用EDC/NHS法與載體蛋白（BSA或OVA）進行連接，免疫小鼠后的AMD mAbs IC50值為 50 μg/L[22];Wu等采用EDC和乙二胺改造載體蛋白（BSA或OVA）的羧基位點使之轉(zhuǎn)換為氨基，然后利用戊二醛法使AMD與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián);制備所得多抗具備一定效價，免疫小鼠后，獲得的AMD mAbs具有較高的效價（1×104以上），但對AMD的抑制率偏低（10%以下）[23]。

雖然紫外掃描、色譜法、SDS-PAGE等通常被用來鑒定免疫原的制備結(jié)果，但是紫外掃描由于半抗原和載體蛋白及偶聯(lián)物的溶解基質(zhì)不同，同時不用的濃度產(chǎn)生的波峰不盡相同，所以判定起來存在困難;色譜法存在操作繁雜、耗時長和須要不斷地熟悉操作等缺點，現(xiàn)實應用起來較為吃力;AMD的分子質(zhì)量較?。?200），與載體蛋白的偶聯(lián)數(shù)目有限[1 ∶ （10～25）]，使得通過SDS-PAGE來判定是否成功聯(lián)結(jié)判定結(jié)果很難用肉眼區(qū)分開來。小鼠血清的IC50鑒定是判斷成功偶聯(lián)最可靠的手段，但是等待時間較長，一旦失敗，須從頭再來，使得試驗周期大大增加。綜上所述，尋找切實可行的免疫原的鑒定方法是廣大免疫工作者須解決的問題。

本研究小鼠的效價均在6.4×103以上，利用細胞融合技術篩選出4株特異性、特異性較強的細胞株，制備出AMD mAbs，并對其效價、敏感性及特異性進行了鑒定，mAbs對AMD的IC50為1.02 μg/L，結(jié)果表明，以該抗體為基礎，能夠為以后AMD殘留的免疫檢測方法的建立提供技術支持。

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