吳玲玲　高宏君　蔣鵬　武楨　周杰彬

【摘? 要】目的：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鹿茸治療腎細(xì)胞癌的作用機(jī)理。方法：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺（BATMAN-TCM）數(shù)據(jù)庫篩選鹿茸所對應(yīng)的靶標(biāo)基因，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選腎細(xì)胞癌的靶標(biāo)基因，通過Venny2.1數(shù)據(jù)庫獲得鹿茸對腎細(xì)胞癌的相關(guān)靶點(diǎn)，利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，利用 David6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析和KEGG信號通路富集分析。結(jié)果：從鹿茸中篩選獲得包括17-β-雌二醇、氨基葡萄糖、三磷酸腺苷、視黃醇等14 個化學(xué)成分及 303 個靶點(diǎn)。鹿茸作用于腎細(xì)胞癌的靶點(diǎn)有20個，主要靶點(diǎn)包括連環(huán)蛋白β1、轉(zhuǎn)化生長因子β1、腫瘤壞死因子、干擾素γ、雌激素受體1、基質(zhì)金屬蛋白酶9、趨化因子受體等。利用 David6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析得到143個生物學(xué)過程，13個細(xì)胞組成，26個分子功能，通過 KEGG 分析富集得到34條通路。結(jié)論： 本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出鹿茸的有效化學(xué)成分，初步預(yù)測了鹿茸作用于腎細(xì)胞癌的靶點(diǎn)并初步揭示了鹿茸對腎細(xì)胞癌的作用機(jī)制，為腎細(xì)胞癌的治療提供了更多可能。

【關(guān)鍵詞】鹿茸;腎細(xì)胞癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)理

【中圖分類號】R29 ?????【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A ?????【文章編號】1004-7484（2020）09-0268-02

腎細(xì)胞癌是起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎癌、腺癌，大多數(shù)腎癌是透明細(xì)胞癌。腎細(xì)胞癌是腎臟最為常見的腫瘤，約占腎腫瘤總數(shù)的75%-80%，約占全部成人惡性腫瘤的2% ～3%，發(fā)病年齡多在40-60歲。腎細(xì)胞癌發(fā)展到晚期，會轉(zhuǎn)移至肺部及骨骼。

鹿茸是一種名貴的中藥材，其表面覆蓋毛發(fā)，內(nèi)部由結(jié)締組織、軟骨、血管與大量神經(jīng)纖維組成。鹿茸首于 《神農(nóng)本草經(jīng)》 ，列為中品，其性溫，味甘、咸，歸肝、腎經(jīng)，具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨等功效。鹿茸是唯一能夠完全再生的哺乳動物組織?！侗静菥V目》記載，鹿茸具有治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、神疲、畏寒、眩暈、耳鳴、耳聾、等功效。中藥成分具有“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究藥物系統(tǒng)性、整體性的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥辨證論治的原則不謀而合。

1.材料

STRING數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、GeneCards 、Venny2.1工具、David 6.8數(shù)據(jù)庫、GraphPad Prism 7.0 軟件、OmicShare數(shù)據(jù)庫等。

2.方法

2.1鹿茸的化學(xué)成分收集與靶點(diǎn)預(yù)測

利用中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析平臺BATMAN-TCM 挖掘鹿茸的化學(xué)成分，通過該服務(wù)器的 “成分-靶點(diǎn)相似性”原理，設(shè)置閥值 “Score cutoff =30”，計算化學(xué)成分對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。

2.2腎細(xì)胞癌潛在作用靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，檢索腎細(xì)胞癌相關(guān)靶點(diǎn)，輸入“renal cell carcinoma”，按“Relevance score”排序取前200 個靶點(diǎn)作為腎細(xì)胞癌疾病的候選靶點(diǎn)。

2.3鹿茸靶點(diǎn)與腎細(xì)胞癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析

利用Venny2.1工具將鹿茸的化學(xué)成分靶點(diǎn)導(dǎo)入到“List1”，將腎細(xì)胞癌相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入到“List2”中進(jìn)行交集比對，最終獲得鹿茸對腎細(xì)胞癌的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.4靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫平臺構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，將最低相互作用閥值設(shè)為中等“medium confidence = 0. 4 ”。

2.5 GO生物過程富集

在David 6.8數(shù)據(jù)庫中，依次選擇 “OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，修改背景為“人類”，選擇“Gene Ontology”，分別勾選“生物過程” 、“分子功能 ”、“細(xì)胞成分” ，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行GO分析，得到鹿茸對腎細(xì)胞癌作用靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果。

2.6 KEGG信號通路分析

在David6.8數(shù)據(jù)庫中，依次選擇“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，修改背景為“人類”，選擇“Pathway-KEGG”，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到OmicShare數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG分析，得到鹿茸對腎細(xì)胞癌作用靶點(diǎn)的KEGG分析的氣泡圖。

3.結(jié)果分析

3.1鹿茸的化學(xué)成分收集與靶點(diǎn)預(yù)測

利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫共挖掘到鹿茸有效化學(xué)成分14個（如表1），對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)363個，經(jīng)刪除重復(fù)項后得到303個潛在靶點(diǎn)，其中包括ABAT、BCL3、COX1、DAO、ESR1、FABP6等。

3.2腎細(xì)胞癌相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，檢索腎細(xì)胞癌相關(guān)靶點(diǎn)，輸入“renal cell carcinoma”共得到7776個相關(guān)基因，按“Relevance score”排序取前200 個靶點(diǎn)作為腎細(xì)胞癌疾病的候選靶點(diǎn)，見表2（僅列出relevance score前10 個）。

3.3鹿茸靶點(diǎn)與腎細(xì)胞癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析

利用Venny 2.1工具將鹿茸靶點(diǎn)與腎細(xì)胞癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，最終獲得20相交靶點(diǎn)，包括CTNNB1、TGFB1、TNF、 IFNG 、ESR1 、SLC2A1 、MMP9 、CXCR4等。

3.4靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將鹿茸靶點(diǎn)與腎細(xì)胞癌靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析獲得的20個相交靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并得出各靶點(diǎn)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖1所示。其中“節(jié)點(diǎn)”代表作用靶點(diǎn)，“邊”代表各靶點(diǎn)之間的相互關(guān)聯(lián)，其“粗細(xì)”用“combine score” 表示，邊越粗，combine score值越大，代表其結(jié)合度越大。由圖可知，共有20個節(jié)點(diǎn)、83條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為8.3，平均局部聚類系數(shù)為0.744。

3.5 GO生物過程富集

利用 David 6.8數(shù)據(jù)庫將鹿茸作用于腎細(xì)胞癌的20個靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 分析，從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能對20個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分類分析，分別得到170、16、33條，P<0. 05 者分別為143、13、26 條。其中生物學(xué)過程包括藥物反應(yīng)、一氧化氮生物合成的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié);細(xì)胞組成包括等離子體膜、細(xì)胞表面、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)域等;分子功能包括酶結(jié)合、類固醇激素受體的活動、類固醇結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合等。

3.6 KEGG 信號通路分析

利用 David 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號通路富集，共得到42條信號通路，P<0.05 者有34條，其中包括癌癥通路、腎細(xì)胞癌、破骨細(xì)胞分化、MAPK信號通路、癌蛋白聚糖等。

4.討論

本文通過對鹿茸“成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了鹿茸 14 個化學(xué)成分及303個潛在靶點(diǎn)，將鹿茸靶點(diǎn)與糖尿病腎病靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析得到20個相交靶點(diǎn)。已有文獻(xiàn)表明，三磷酸腺苷在抗人食管癌細(xì)胞增殖方面有較強(qiáng)的作用，LRAT和RDH12是視黃醇代謝相關(guān)基因，對宮頸鱗癌細(xì)胞具有抑制效果，氨基葡萄糖具有抗腫瘤和增強(qiáng)免疫的功能。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，推測鹿茸可能通過作用于視黃醇X受體RXRA從而影響癌癥信號通路發(fā)揮藥效。故三磷酸腺苷、視黃醇和氨基葡萄糖可能是鹿茸潛在的抗腫瘤成分，并通過癌癥通路等信號通路發(fā)揮抗腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)17-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細(xì)胞的侵襲具有有效的抑制作用;研究表明注射前列腺素E17d對腫瘤有抑制作用。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示鹿茸中17-β-雌二醇、前列腺素E1能夠作用到ESR1、ESR2關(guān)鍵靶點(diǎn)，推測鹿茸可能通過作用于這些靶點(diǎn)從而影響癌蛋白多糖等信號通路發(fā)揮藥效。綜合文獻(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，證明鹿茸在治療腫瘤疾病方面具有潛在的優(yōu)勢。然后，對鹿茸作用于腎癌的主要的20個靶點(diǎn)進(jìn)行DAVID分析得到生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能等相關(guān)信息。

P<0.05 的生物過程有143個，包括藥物反應(yīng)、一氧化氮生物合成的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)等。主要涉及氧化應(yīng)激、抗炎、抗氧化等方面。有研究表明，經(jīng)高鎂培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中NO產(chǎn)生增加，可防止NF-κB活化，降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）活性。研究表明，MMP-9蛋白的表達(dá)對腫瘤的分化程度、侵襲與轉(zhuǎn)移有影響，故推測一氧化氮生物合成的正調(diào)節(jié)與腎癌的方式密切相關(guān)。P<0.05 的分子功能有26個，包括蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合等。蛋白結(jié)合是指藥物進(jìn)入血液循環(huán)與血漿蛋白結(jié)合，成為結(jié)合型藥物，暫時失去一般藥理活性，并 “儲存”在血液中。一般蛋白結(jié)合率高的藥物體內(nèi)消除較慢，作用時間長。P<0.05 的細(xì)胞組成有13個，包括蛋白質(zhì)復(fù)合體、胞外區(qū)、胞核、胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙等。

對鹿茸作用于腎癌的主要的20個靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，得到 P<0. 05 的通路34條。其中HIF-1信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路等與腎癌有關(guān)。HIF-1是一類轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在正常條件下，HIF-1處于不穩(wěn)定狀態(tài)，通過VHL介導(dǎo)的泛素化降解;在缺氧條件下，HIF-1處于穩(wěn)定狀態(tài)，可激活相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生損傷、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腎癌的發(fā)生和發(fā)展過程中VHL/HIF信號通路起著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制VHL/HIF信號通路，腎癌細(xì)胞增殖活性降低，侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。TGF-β是腫瘤微環(huán)境中的重要成分之一，可由腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞等多種成分分泌。TGF-β與其受體結(jié)合后可通過Smad依賴或非依賴方式介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。有研究表明，TGF-β在腎癌等腫瘤具有較高的表達(dá)水平，且血清與尿中的TGF-β水平與腎癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。有多項研究指出，在大腸癌，乳腺癌，腎癌，前列腺癌癥患者中，血清或者腫瘤組織 TGF-β水平明顯高于正常人。 MAPK信號通路能介導(dǎo)如炎性細(xì)胞因子、細(xì)菌產(chǎn)物、物理、化學(xué)應(yīng)激等刺激引起的細(xì)胞反應(yīng)，可參與多種生理過程，如細(xì)胞形成、運(yùn)動、凋亡、分化及生長增殖等。MAPK途徑被稱為蛋白激酶的級聯(lián)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。有研究表明，MAPK信號通路可能參與腎細(xì)胞癌進(jìn)展過程中的增殖和轉(zhuǎn)移過程中miR-106b/CIC軸的調(diào)控。

綜上所述，鹿茸治療腎細(xì)胞癌的有效成分主要包括三磷酸腺苷、氨基葡萄糖、17-β-雌二醇、前列腺素 E1等，鹿茸可能主要通過抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞生長等方面來治療腎細(xì)胞癌。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得鹿茸治療腎細(xì)胞癌的可能有效成分及潛在作用靶點(diǎn)，但本研究僅為預(yù)測分析，上述有關(guān)結(jié)論及具體作用機(jī)制還有待后續(xù)研究加以論證，不斷完善。

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作者簡介：

吳玲玲（1995-），漢，女，廣西桂林，碩士在讀，研究方向：泌尿外科。

通訊作者：

高宏君（1972-），滿，男，吉林長春，博士，主任醫(yī)師，研究方向：泌尿外科，器官移植。

基金項目：

1.廣西自然科學(xué)基金面上項目，2017GXNSFAA198080.

2.廣西壯族自治區(qū)中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目，2019KY0317.

3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)2018年廣西一流學(xué)科建設(shè)項目重點(diǎn)課題，2018XK085.

4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)2019-2011年廣西一流學(xué)科建設(shè)項目，2019XK173.

5.廣西中醫(yī)藥大學(xué)2019-2011年廣西一流學(xué)科建設(shè)項目青年基金項目，2019XK176.