姚佳

【摘? 要】目的：通過對(duì)肝細(xì)胞肝癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，從而對(duì)肝細(xì)胞肝癌的基因組的異質(zhì)性和生物學(xué)機(jī)制有一個(gè)更加全面的理解。方法：對(duì)10例肝細(xì)胞肝癌患者，對(duì)癌及癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果：每個(gè)樣本大量的表達(dá)差異的長鏈非編碼RNA（范圍為54到69）和差異表達(dá)的基因（范圍為2971到6910）。共2873個(gè)具有明顯表達(dá)差異的基因，其中上調(diào)1666個(gè)，下調(diào)1207個(gè)（差異基因標(biāo)準(zhǔn)：FDR<0.001， Foldchang≥2， 存在于5對(duì)樣本以上）。對(duì)差異基因的功能分析結(jié)果顯示：差異基因主要集中在細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附、脂代謝和炎癥等功能類和PPRA、P450的代謝、P53和DNA的復(fù)制等信號(hào)通路。此外，每個(gè)樣本發(fā)現(xiàn)了大量的腫瘤特異性突變，其中22.2%位于基因的編碼區(qū)，大部分（42.6%）為T：A >C：G這一類型的突變。結(jié)論：對(duì)差異基因的分析顯示主要集中于細(xì)胞周期、PPRA和P53等信號(hào)通路，表明這些信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。對(duì)于腫瘤特異性突變的分析，高頻的T：A >C：G這一突變類型的發(fā)生，我們推測基因突變主要發(fā)生在RNA編輯這一過程中，這表明RNA編輯對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展有相當(dāng)大的影響。大量的新的基因事件的發(fā)生，說明肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制比以往的理解更為復(fù)雜。

【關(guān)鍵詞】肝癌;轉(zhuǎn)錄組測序;RNA編輯

【中圖分類號(hào)】R158????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????? 【文章編號(hào)】1004-7484（2020）09-0288-02

肝細(xì)胞肝癌占了原發(fā)性肝臟腫瘤的80—90%，居全世界腫瘤發(fā)病率的第五位，腫瘤相關(guān)性死亡的第三位^[1]。肝細(xì)胞肝癌是一種具有高度侵襲性的腫瘤，盡管采用了以手術(shù)切除為主的一系列綜合治療手段，但是肝癌患者的長期生存率仍然較低^[2-3]。肝細(xì)胞肝癌是一種異質(zhì)性疾病，由于基因、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄組水平的改變，使得肝細(xì)胞肝癌的形態(tài)學(xué)和臨床表現(xiàn)多樣性^[4] 這些遺傳多樣性嚴(yán)重影響了肝癌的診斷、治療及預(yù)后。

對(duì)于肝細(xì)胞肝癌分子水平的轉(zhuǎn)錄組研究成為了近年研究的熱點(diǎn)，并且對(duì)于進(jìn)一步篩選肝癌診斷及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子、揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和尋找新的靶向治療位點(diǎn)顯示出了不可估量的潛力。本研究圍運(yùn)用二代測序技術(shù)，對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行深入測序，以尋找新的肝癌診斷及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子和通路，對(duì)肝細(xì)胞肝癌的分子生物學(xué)機(jī)制有一個(gè)更加全面和深入的理解為目標(biāo)。

1方法及材料：

1.1 收集本院 2015 年 1 月至 2018 年 12月接受肝癌肝切手術(shù)的男性病人，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性HCC，且均為HBV相關(guān)性肝癌，無合并HCV等其他肝炎病毒感染。臨床病理學(xué)資料完整，包括年齡、性別、術(shù)前AFP水平、有無血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分化分級(jí)、腫瘤大小、數(shù)目等。術(shù)前均未行抗腫瘤治療，手術(shù)切除的組織立即冷凍于-80 ℃以用于提取RNA。

1.2 主要試劑：美國Invitrogen 公司Trizol總RNA提取試劑;上海生工生物工程有限公司 DEPC、瓊脂糖;美國Illumina公司DNase I，oligo（dT），fragmentation buffer，random hexamers，緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I，polyA， QiaQuick PCR試劑盒;其他化學(xué)試劑：氯仿、異丙醇、無水乙醇、甲醇、等均為國產(chǎn)分析試劑。

1.3實(shí)驗(yàn)方法：

1.3.1轉(zhuǎn)錄組測序：RNA-Seq 由深圳華大基因公司所做，簡要步驟如下： 分別提取樣本的總RNA，使用 DNase 消化 DNA 后富集mRNA，用打斷試劑將mRNA打斷成短片段并以此為模板合成 cDNA， 使用試劑盒純化雙鏈 cDNA 再進(jìn)行末端修復(fù)、加 A 尾， 連接接頭后選擇合適的片段大小進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建好的文庫用 Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)檢合格后，使用 Illumina HiSeqTM 2500 測序儀進(jìn)行測序，上樣量為 50 ng。

1.3.2測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估及處理

測序得到的原始數(shù)據(jù)為raw data，接下來數(shù)據(jù)處理的步驟：（1）去除含adaptor的reads;（2）去除N的比例大于5%的reads;（3）去除低質(zhì)量reads（質(zhì)量值Q≤15的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上）。得到Clean data后，我們使用MAQ 軟件將clean reads 與參考序列進(jìn)行比對(duì)，每個(gè)read的堿基錯(cuò)配不能大于5個(gè)。

1.3.3差異表達(dá)基因（DEGS）的篩選

對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)分析，基因表達(dá)量使用 FPKM（ Fragments Per kb per Million reads） 方法計(jì)算，以校正的 P 值（ false discovery rate， FDR） ≤0. 05、差

異倍數(shù)的對(duì)數(shù)絕對(duì)值（ ︱log2FoldChange︱，︱FC︱） ≥2為閾值，篩選癌和癌旁的DEGS。1.3.4 差異表達(dá)基因的 GO 分析和 KEGG 富集篩選出 DEGs 后，我們對(duì) DEGs 進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析。

2結(jié)果：

2.1 表達(dá)差異：（圖1）

我們選擇10例肝癌樣本及相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），10對(duì)樣本平均生成26 355 902 （range： 25 580 346-27 540 350） reads和2.37（range： 2.30-2.48）Gb的測序數(shù)據(jù)。采用MAQ軟件，平均92.76% （range： 89.37-97.02%）的reads能夠比對(duì)到人類基因組（UCSC version hg19）。通過比對(duì)腫瘤及其配對(duì)癌旁組織的轉(zhuǎn)錄本，我們篩選到每對(duì)肝癌樣本中具有表達(dá)差異的基因（2971 to 6910）。

2.2差異基因及GO和pathway分析

通過將10對(duì)樣本的read比對(duì)到基因組后，計(jì)算他們的表達(dá)量，用RPKM來衡量他們的表達(dá)量。通過將癌和癌旁組織的RPKM值進(jìn)行比較，計(jì)算他們的表達(dá)差異。將10對(duì)樣本的差異基因進(jìn)一步按以下條件篩選：FDR ≤ 0.001，foldchang≥ 2，上調(diào)或者下調(diào)在5對(duì)樣本以上。共獲得2873個(gè)基因，隨后進(jìn)行GO和pathway的分析，結(jié)果表明，差異基因主要集中于細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞粘附、類固醇及脂類代謝、依賴于DNA的修復(fù)及炎癥免疫反應(yīng)等功能類和P53、細(xì)胞周期，PPRA，DNA修復(fù)等信號(hào)通路，具體結(jié)果見圖2及表1。隨后對(duì)于10對(duì)樣本中一致上調(diào)或下調(diào)的106個(gè)基因進(jìn)行聚類，見圖3

2.3 SNP及腫瘤特異性突變：

每個(gè)肝癌樣本平均找到12909（范圍為6877-27970）個(gè)腫瘤特異性點(diǎn)突變，這些突變位點(diǎn)22.2%位于基因編碼區(qū)域（CDS區(qū)），其中946個(gè)為非同義突變。其中42.6%為T：A >C：G（圖4）。

討論：

從分子生物學(xué)的角度講，肝癌和其他腫瘤一樣，是一種復(fù)雜的疾病^[4-5]。過去的幾十年的研究已經(jīng)證明，基因的改變?cè)诟伟┑陌l(fā)生發(fā)展因此起著重要的作用^[6-8]。對(duì)于肝癌的基因?qū)W特征的更加詳細(xì)的了解，能夠促進(jìn)肝癌在診斷，治療及預(yù)后等方面發(fā)展。本研究中，我們對(duì)10例肝癌及其癌旁組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，通過這些數(shù)據(jù)及聯(lián)合分析，我們首先分析了腫瘤及癌旁組織基因的表達(dá)差異，其中有很多基因已經(jīng)被證實(shí)與肝癌的發(fā)生有關(guān)，例如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）^[9-11]。同樣，也發(fā)現(xiàn)了很多新的未被注釋的基因被找到，這說明基于轉(zhuǎn)錄組測序來尋找表達(dá)差異的基因是一種更加高效的研究方式。在這些信號(hào)通路中，大部分已經(jīng)被報(bào)道證實(shí)與肝癌的發(fā)展具有密切的關(guān)系，例如細(xì)胞周期的信號(hào)通路、P53、PPAR等^[12]。同時(shí)，差異基因在一些基本的代謝途徑中被富集，例如，類固醇的代謝、脂肪酸的代謝。特別有趣的是，細(xì)胞色素P450這一信號(hào)通路，許多該家族的基因在肝癌組織中明顯的下調(diào)，這與先前關(guān)于肝癌組織中細(xì)胞色素P450分子的活性降低及低表達(dá)相一致^[13]?？偠灾?，轉(zhuǎn)錄組測序揭示肝癌的發(fā)生涉及到多條關(guān)鍵的細(xì)胞通路，包括細(xì)胞生長相關(guān)的通路，代謝相關(guān)的過程及免疫相關(guān)的調(diào)劑通路。

人類的基因是由多個(gè)外顯子中穿插著內(nèi)含子來構(gòu)成。初級(jí)轉(zhuǎn)錄本RNA通過RNA的剪切的過程，內(nèi)含子被去除，成為一個(gè)成熟的mRNA.通過選擇性剪切的機(jī)制，一個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本能夠生成多個(gè)mRNA^[14]。RNA的選擇性剪切起著重要的生物功能，例如膜結(jié)合蛋白IgM和分泌蛋白IgD 是由同一個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過選擇性剪接所產(chǎn)生^[15]。已有許多基于基因組的基礎(chǔ)上，對(duì)于RNA選擇性剪切的研究，這些研究表明人類35-39%的基因至少有一個(gè)選擇性剪切異構(gòu)體^[16-19]。一些研究顯示，RNA選擇性剪切頻繁的發(fā)生于腫瘤相關(guān)的基因，例如EGFR，CD44，NER^[20-22]。本研究基于基因組學(xué)的基礎(chǔ)上，尋找與肝癌相關(guān)的選擇性剪切事件，作為肝癌診斷的一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物。突變位點(diǎn)22.2%位于基因編碼區(qū)域（CDS區(qū)）其中42.6%為T：A >C：G，對(duì)于這一現(xiàn)象，合理的解釋為這種類型的點(diǎn)突變發(fā)生在RNA編輯過程中。RNA編輯過程中將腺嘌呤（A）改變?yōu)榇吸S嘌呤核苷酸（I），而后次黃嘌呤核苷酸被翻譯為鳥嘌呤核苷酸（G）^[23]。

針對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)了大量的新的基因事件的發(fā)生，包括選擇性剪接、腫瘤特異性突變等，說明肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制比以往的理解更為復(fù)雜。這一較為全面的肝癌轉(zhuǎn)錄組水平的研究，為我們進(jìn)一步研究肝癌發(fā)病的分子機(jī)制提供了重要的線索和參考價(jià)值。

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基金資助：

2017浙江省教育廳課題（Y201738263）