劉書暢，李榮春**，馬布平，羅祥英，李夢杰，曹 瑤，聞邵峰，周忠發(fā)，楊林雷

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所，云南 昆明 650201；2.云南菌視界生物科技有限公司，云南 昆明 650100）

金耳（Tremella aurantialbaBandoin et Zang），又名金木耳、黃耳、金銀耳、黃金銀耳、黃木耳、腦耳、腦形銀耳，在分類學(xué)上隸屬于菌物界（Fungi）擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 銀耳綱 （Tremellomycetes） 銀耳目 （Tremellales） 銀耳科 （Tremellaceae） 銀耳屬（Tremella）[1-3]。金耳主要分布于歐洲、亞洲、南北美洲和大洋洲，屬于世界分布型真菌，但其種源卻很少。通過金耳菌種生產(chǎn)工藝研究，提高菌種活力、抗雜能力等，對提高金耳生物學(xué)效率，縮短生長周期等具有重要意義[4-6]。

國內(nèi)外學(xué)者對金耳的研究除了生物學(xué)特性、資源分布、營養(yǎng)物質(zhì)的測定[7-8]，主要集中在深層發(fā)酵等方面，如鄧超等[9-12]對金耳發(fā)酵液多糖的成分與作用的相關(guān)研究。近年來云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所對金耳菌生物學(xué)特性、資源分布、優(yōu)良菌株優(yōu)化篩選、栽培技術(shù)、營養(yǎng)物質(zhì)測定等方面進行深入研究，為金耳菌種生產(chǎn)工藝的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)[13]。

1974年～1977年福建省三明真菌研究所黃年來等[14]對金耳生活條件、菌種分離與制作、段木栽培試驗成功；1982年后，金耳人工栽培開始大面積示范推廣，在金耳人工栽培的幾十年間，因生產(chǎn)菌種不同性狀帶來的生物學(xué)效率低、生長周期長等問題明顯，本次試驗通過對菌種生產(chǎn)技術(shù)的研究，以獲得較為理想的菌種及配套生產(chǎn)技術(shù)[15-19]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株CYJ和試驗所需材料由云南菌視界生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 母種碳源、氮源篩選

1） 母種碳源篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CK）：蛋白胨 3 g、瓊脂 18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水1 000 mL，pH自然。分別將不同的碳源稱取20 g加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配方見表1。常規(guī)制作，接種后置于20℃恒溫培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)，第3天開始劃線，每天同一時間記錄菌絲、子實體的生長情況，測量菌絲生長速度，5次重復(fù)，使用EXCEL、SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行平均數(shù)處理并分析。

表1 不同碳源培養(yǎng)基配方

2） 母種氮源篩選

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CK）：葡萄糖20 g、瓊脂18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水1 000 mL，pH自然。將不同的氮源分別稱取3 g加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配方見表2。常規(guī)制作，接種后置于20℃恒溫培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)，記錄分析方法同母種碳源篩選試驗的方法。

表2 不同氮源培養(yǎng)基配方

3）母種碳氮源組合篩選

綜合PDA培養(yǎng)基（CK）：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 3 g、瓊脂 18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水1 000 mL，pH自然；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：瓊脂 18 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g，水 1 000 mL，pH自然。具體配方見表3。常規(guī)制作，接種后置于20℃恒溫培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)，記錄分析方法同母種碳源篩選試驗的方法。

表3 不同組合碳氮源配方

1.2.2 原種配方篩選試驗

本試驗設(shè)計5種培養(yǎng)基配方[20-24]，即配方1：木屑87%、玉米粉11%、蔗糖1%、石膏1%；配方2：木屑75%、玉米粉10%、麥麩13%、蔗糖1%、石膏1%；配方3：木屑74%、麥麩24%、蔗糖1%、石膏1%；配方4：木屑64%、麥麩24%、玉米粉10%、蔗糖1%、石膏1%；配方5：木屑52%、棉籽殼23%、麥麩23%、蔗糖1%、石膏1%。

常規(guī)裝瓶滅菌后在18℃培養(yǎng)條件下暗培養(yǎng)，觀察記錄菌絲、子實體生長情況，菌種生長周期，測量菌絲生長速度，使用EXCEL、SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行平均數(shù)處理并分析。

1.2.3 培養(yǎng)基碳氮比篩選試驗

最適配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，計算其碳氮比，設(shè)置碳氮比梯度：490∶1、440∶1、390∶1、340∶1、290∶1、240∶1。計算對應(yīng)配方，裝料滅菌，接種后在18℃培養(yǎng)條件下暗培養(yǎng)，數(shù)據(jù)記錄、分析方法同1.2.2，篩選出最適的碳氮比。

1.2.4 原種pH篩選試驗

按照碳氮比為390∶1的培養(yǎng)料配方為木屑91.4%、玉米粉6.6%、石膏1%、糖1%，含水量58%，培養(yǎng)溫度18℃。設(shè)置pH梯度為5、5.5、6、6.5、7，稱取好培養(yǎng)料之后，使用0.1 mol·L-1的NaOH、HCl試劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)料pH，PHS-2C型酸度計測定。常規(guī)滅菌，接種培養(yǎng)，數(shù)據(jù)記錄、分析方法同1.2.2。

1.2.5 原種培養(yǎng)溫度試驗

1） 恒溫試驗

培養(yǎng)料配方同1.2.4，含水量58%，在最適pH前提條件下，設(shè)置恒溫培養(yǎng)溫度梯度為14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃，接種后在不同溫度梯度下培養(yǎng)，記錄、分析方法同1.2.2。

2） 變溫試驗

培養(yǎng)料配方同1.2.4，含水量58%，在最適pH前提條件下，首先在22℃的條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)不同天數(shù)后轉(zhuǎn)移到18℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以達到變溫培養(yǎng)的效果，變溫時間梯度為3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d、24 d。記錄分析方法同1.2.2。

1.2.6 不同性狀菌種出菇試驗

在菌種培育過程中，菌種會呈現(xiàn)帶黃水、被革菌包裹、子實體“自溶”等現(xiàn)象，即設(shè)置帶黃水、被革菌包裹、子實體“自溶”與正常的4種性狀的菌種進行出菇比較。4種不同性狀菌種分別接種到培養(yǎng)革菌菌絲35 d的栽培袋中，在20℃條件下培養(yǎng)，通過記錄分析子實體長勢、定植率、出菇率、生長周期、計算生物學(xué)效率得到最佳菌種。

2 結(jié)果分析

2.1 不同碳源、氮源對金耳菌生長的影響

2.1.1 不同碳源對金耳菌生長的影響

不同碳源對金耳菌生長影響情況見表4。

表4 不同碳源對金耳菌生長影響情況

由表4可知，金耳菌能較好吸收多種碳源，無碳源時不能生長，添加碳源使菌絲、子實體長勢不同程度變好、生長速度加快；其中果糖為碳源時菌絲生長速度最快、葡萄糖次之，分別為0.36 cm·d-1、0.35 cm·d-1；半乳糖為碳源時子實體長勢旺，菌絲長勢較好，生長周期較短。綜合金耳混合菌絲長勢、子實體生長勢及其生長周期，半乳糖為本次試驗最好的碳源，果糖、麥芽糖次之，糊精不利于金耳生長。

2.1.2 不同氮源對金耳生長的影響

在不同氮源培養(yǎng)基中，金耳混合菌絲的生長速度大多呈顯著或極顯著差異。酵母膏為氮源時金耳混合菌絲生長速度最快，為0.531 cm·d-1；硝酸鉀時為氮源時菌絲生長最慢，為0.217 cm·d-1；無氮源的培養(yǎng)基中金耳混合菌絲的生長速度較慢，為0.33 cm·d-1；尿素為氮源的培養(yǎng)基會抑制金耳混合菌絲、子實體的生長。金耳菌可較好吸收酒石酸銨、氯化銨、酵母膏，不能較好吸收尿素、牛肉膏、硫酸銨。綜合金耳混合菌絲、子實體長勢，生長周期，酵母膏、氯化銨、酒石酸銨作碳源時金耳子實體長勢較好，在生產(chǎn)菌種時皆可采用，酒石酸銨為最佳氮源。

2.1.3 不同碳源、氮源組合對金耳生長的影響

不同組合碳源對金耳生長的影響情況見表5。

表5 不同組合碳源對金耳生長的影響情況

表5試驗結(jié)果表明，3種優(yōu)質(zhì)碳源、氮源營養(yǎng)添加劑相互組合培養(yǎng)金耳菌，金耳混合菌絲生長速度少數(shù)呈顯著或極顯著差異。酵母膏與半乳糖組合時菌絲生長速度快，為0.405 cm·d-1，菌絲長勢旺盛、粗壯，但子實體膨大不明顯、長勢弱，菌種易老化。氯化銨與半乳糖、酒石酸銨與半乳糖組合時，菌絲、子實體長勢旺盛，生長速度快，最佳組合為酒石酸銨與半乳糖，其他幾種組合營養(yǎng)劑添加時，菌絲長勢、子實體長勢無明顯差異，均適宜金耳菌的生長。

2.2 原種配方篩選試驗

菌株在5種培養(yǎng)基中的生長情況見表6。

由表6可知，原種培養(yǎng)基配方1與其他4種培養(yǎng)基中金耳混合菌絲的生長速度呈極顯著差異，且

表6 菌株在5種培養(yǎng)基中的生長情況

2.3 原種培養(yǎng)基質(zhì)碳氮比篩選試驗

不同碳氮比培養(yǎng)基對金耳菌的生長影響情況見表7。

表7 不同碳氮比培養(yǎng)基對金耳菌的生長影響情況

圖1 金耳在不同碳氮比培養(yǎng)基中的生長情況

由表7、圖1可知，金耳混合菌絲在不同碳氮比培養(yǎng)基其中生長速度呈顯著差異，混合菌絲在碳氮比為390:1的培養(yǎng)基生長最快，490:1時生長最慢。氮源的增加使菌絲更加濃密、旺盛，子實體長勢較好，周期縮短，但成耳率降低。綜合考慮菌絲、子實體生長勢及生長周期，生產(chǎn)時配方碳氮比為390:1較適宜，即對應(yīng)的配方為：木屑91.4%、玉米粉6.6%、石膏1%、糖1%。

2.4 pH對金耳菌生長的影響

不同pH對金耳菌生長的影響情況見表8。

表8 不同pH對金耳菌生長的影響

由表8可知，培養(yǎng)料中pH呈梯度增加時，菌絲生長速度呈顯著性或極顯著性差異，pH為6.5時金耳混合菌絲生長最快、長勢一般，子實體長勢旺盛、成耳率高、生長周期短。培養(yǎng)料中pH為6.5時，pH增大或減小，菌絲、子實體的生長情況都會變差，成耳率降低、生長周期變長。即，金耳生長所需的最適酸堿度范圍為5.5～6.5，最佳的pH為6.5，嚴(yán)格控制滅菌條件、接種時間，減小其他因素的影響。

2.5 溫度對金耳菌生長的影響

2.5.1 不同恒定溫度對金耳菌生長的影響

不同溫度培養(yǎng)條件下，金耳混合菌絲生長速度呈顯著性或極顯著性差異。22℃時，菌絲生長速度最快，14℃時，菌絲生長速度最慢；供試培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度在14℃～22℃時，菌絲生長速率隨溫度的升高而加快；溫度在22℃～28℃時，菌絲生長速率隨溫度的升高而減小；子實體在20℃時長勢最強，在此基礎(chǔ)上，溫度升高或降低都會抑制子實體生長。綜合考慮幾種因素，最適宜的培養(yǎng)溫度范圍為18℃～22℃。

2.5.2 變溫處理對金耳菌生長的影響

試驗表明，變溫時間短，金耳成耳率高、周期長；變溫時間長，金耳成耳率低、周期短。金耳混合菌絲在22℃培養(yǎng)條件下，菌絲生長速度較快，12 d后菌絲長滿瓶，變溫時間為9 d時，成耳率最高。綜合考慮幾個因素，最適變溫時間為3 d～9 d。在生產(chǎn)過程中，依據(jù)生產(chǎn)條件、經(jīng)濟效益，適當(dāng)調(diào)整金耳變溫時間，變溫時間為9 d比較適宜，此處理成耳率高，生長周期較短。

2.6 不同性狀菌種出菇效果

不同性狀菌種出菇情況見表9。

表9 不同性狀菌種出菇情況

由表9可知，正常菌種接種后出菇培養(yǎng)，定植率、出菇率、生物學(xué)效率最高，革菌包裹菌種次之，其他2種較低；出菇率在定植率的基礎(chǔ)上相應(yīng)降低，生長周期無顯著差異；正常菌種出菇質(zhì)量較好，生物學(xué)效率高達44%，革菌包裹菌種、帶黃水菌種、自溶菌種的生物學(xué)效率依次為32%、23%、15%。

標(biāo)準(zhǔn)菌種的出菇效果最好，轉(zhuǎn)色一致、朵型大小相似、出菇整齊。帶黃水菌種有革菌包裹、攜帶黃水等問題，接種后的子實體易污染、膨大困難?！白匀芫N”開裂部分不易膨大或膨大速度慢、易污染、出菇不整齊等問題嚴(yán)重。

3 討論

本試驗得到的最佳碳源、氮源分別為半乳糖、酒石酸銨，并將2種最佳碳氮源進行組合優(yōu)化，得到最佳碳源、氮源組合為半乳糖+酒石酸銨，這與趙永昌等[25]在金耳最佳碳源、氮源方面研究的結(jié)果有所出入，可能是試驗菌株、碳源和氮源篩選的方法不同而形成的差異。試驗配方的篩選是在劉正南[15]等的研究基礎(chǔ)上，以找到金耳菌適宜生長的培養(yǎng)基質(zhì)為目的，結(jié)合試驗材料的實用、經(jīng)濟等因素選擇5種配方進行篩選后優(yōu)化，得到最佳配方為木屑91.4%、玉米粉6.6%、石膏1%、糖1%。通過pH、溫度。試驗結(jié)果表明，金耳生長適宜的pH范圍為5.5～6.5，恒溫培養(yǎng)溫度為18℃～22℃，與吳錫鵬[26]等在金耳栽培技術(shù)中的研究結(jié)果相似，目前金耳生產(chǎn)的菌種有被革菌包裹、帶黃水、“自溶”等較典型的情況，通過與“標(biāo)準(zhǔn)菌種”進行出菇比較，更加深刻的了解到問題菌種與優(yōu)質(zhì)菌種的差異，同時體現(xiàn)了優(yōu)質(zhì)菌種的重要性。

金耳子實體是金耳菌絲與毛韌革菌菌絲的復(fù)合體，需要的生長條件較為復(fù)雜，試驗考慮到此因素，通過變溫培養(yǎng)金耳菌；變溫過程是先經(jīng)過較高溫度培養(yǎng)一段時間后，再進行較低溫度培養(yǎng)；采取變溫培養(yǎng)、先高溫后低溫的方法可有效考慮到金耳屬于伴生菌，幼耳生長發(fā)育時菌絲過于旺盛會抑制子實體膨大，同時出現(xiàn)黃水、“自溶”等問題。

本次試驗主要集中在菌種的營養(yǎng)需求、培養(yǎng)條件的篩選上，對于培育優(yōu)質(zhì)菌種只做了部分工作，在金耳菌優(yōu)良菌株、適宜容器、接種工藝、出菇管理等多方面需要進行深入研究，才能培育出更加優(yōu)質(zhì)的金耳菌種。