孔寧寧，楊 勇，姜慧濤

（河北體育學(xué)院，河北 石家莊 050041）

益生菌是一種有益于人體健康的產(chǎn)品，具有免疫調(diào)節(jié)、促使腸道功能的改善、促進(jìn)消化和預(yù)防腹瀉等功能。目前，益生菌被廣泛應(yīng)用于人類生活的各方面，可作為輔助添加食品和膳食補(bǔ)充劑[1]。香菇（Lentinus edodes） 中提取出重要的生物活性物質(zhì)香菇多糖，其具有增強(qiáng)人力免疫力、促進(jìn)腸胃消化和恢復(fù)等功能。長期攝入含有香菇多糖成分的食物，可以穩(wěn)定腸道消化功能，提高身體免疫能力，在藥品和保健類食品中應(yīng)用前景廣闊[2]。運(yùn)動(dòng)員需要大量的日常訓(xùn)練，在日常運(yùn)動(dòng)中的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，對(duì)胃腸道產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激刺激，使得腸胃正常生理功能運(yùn)轉(zhuǎn)受損，胃腸道中菌落的結(jié)構(gòu)遭到破壞，最終會(huì)因?yàn)槲刚衬すδ艿膿p傷和調(diào)節(jié)失衡引發(fā)運(yùn)動(dòng)型腸胃綜合癥，使得腸胃功能紊亂。研究表明，保證運(yùn)動(dòng)員腸道菌群的多樣性和豐度可有效改善其癥狀，成為防治運(yùn)動(dòng)性胃腸綜合征的新方法[3]。咀嚼片是一種在口腔內(nèi)嚼碎后咽下的片劑形式，根據(jù)需要可制成不同形狀的異形片，目前市面上存在較多的保健品咀嚼片，保存及使用較為方便，是市場(chǎng)熱銷的產(chǎn)品，在醫(yī)藥與食品領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用，并且益生菌咀嚼片的制備工藝較為成熟，片劑中的益生菌存活率較高[4]，本研究根據(jù)益生菌和香菇多糖對(duì)腸道微生態(tài)的改善作用，設(shè)計(jì)開發(fā)出一種香菇益生菌復(fù)合咀嚼片，選擇體育系在校大學(xué)生作為研究對(duì)象，探究益生菌香菇復(fù)合咀嚼片對(duì)運(yùn)動(dòng)員的腸胃調(diào)節(jié)作用。采用超聲波協(xié)同酶法提取香菇多糖工藝，具有條件溫和，提取周期較短等優(yōu)點(diǎn)[5]。

1 原材料與方法

1.1 原材料

干香菇，采購于本地蔬菜食品超市；菌株、無水酒精、葡萄糖、苯酚、DEAE-纖維素，采購于昊宏生物制劑銷售中心；檸檬酸、甘露醇、可溶性淀粉、預(yù)膠化淀粉、可壓蔗糖、噴霧干燥一水乳糖、硬脂酸鎂、食用粉沫香精，采購于安泰食品添加劑有限公司。

1.2 主要儀器

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；臺(tái)式低速離心機(jī)，廣州吉迪儀器有限公司；HH-M4數(shù)顯恒溫水浴加熱鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；WN-20萬能粉碎機(jī)，南京科立華儀器儀表；FRE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DZF-6090真空干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海悅豐儀器有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器、流式細(xì)胞儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、可見光分光光度計(jì)、自動(dòng)部分收集器、高速冷凍離心機(jī)、壓片機(jī)等，上海一恒科技有限公司。

1.3 制作步驟

益生菌香菇咀嚼片的制作流程主要為：香菇多糖的提取、益生元活性的篩選和咀嚼片的壓制成型。

1.3.1 香菇多糖的提取工藝

香菇多糖的提取按照以下步驟進(jìn)行：香菇粉碎→超聲波提取→pH調(diào)節(jié)→復(fù)合酶提取→滅酶→離心→濃縮沉淀→冷凍→干燥→香菇多糖純化→多糖含量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，超聲波提取優(yōu)化工序?yàn)椋毫弦罕葹?∶15（g·mL-1），超聲處理溫度條件是70℃，超聲處理時(shí)長為12 min，酶解時(shí)長為50 min，復(fù)合酶的添加量為3%（復(fù)合酶成份質(zhì)量比為木瓜蛋白酶:纖維素酶:果膠酶為1∶1∶1），酶解的溫度條件為60℃，酶解的pH為5.5，在此優(yōu)化條件下香菇多糖提取率為12.46%[5]。最終香菇多糖純度為88.15%。

1.3.2 益生元活性的篩選

制備香菇多糖培養(yǎng)基→菌株培育活化→菌株篩選→測(cè)定菌株生長曲線→測(cè)定香菇多糖對(duì)植物乳桿菌益生元的活性影響。

為了更多地發(fā)揮香菇多糖的優(yōu)勢(shì)，得到活性更高的益生元，實(shí)驗(yàn)最終決定采用多糖含量為88.15%的中性香菇多糖和有益菌植物乳桿菌C88結(jié)合使用的方法，生產(chǎn)制成益生菌咀嚼片。

1.3.3 咀嚼片的壓制成型

選擇預(yù)膠化淀粉、噴霧干后加乳糖、可壓性蔗糖、甘露醇、硬脂酸鎂、食用粉沫香精作為生產(chǎn)益生菌咀嚼片的輔料。按照比例輔料0.3 g，香菇多糖益生菌0.2 g進(jìn)行混合，混合充分后。在壓力設(shè)定為200 MPa的條件下，每一粒香菇多糖咀嚼片的質(zhì)量設(shè)定為0.5 g，最后將原料和輔料混合攪拌均勻，在設(shè)定的壓力下直接壓制成圓形咀嚼片。

原輔料準(zhǔn)備過目篩→原料與輔料預(yù)混過篩3次→壓片→包裝。

采用相同的方法制備不含香菇多糖和益生菌，剩余成分含量相同的咀嚼片，作為對(duì)照組咀嚼片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[6]。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)分組

選擇體育系在校大學(xué)生100名，保證所有選取的在校大學(xué)生都正常參加高強(qiáng)度課程訓(xùn)練，各個(gè)專業(yè)的均涉及且人數(shù)均等，男女比例均等，年齡分布在20歲～22歲，無任何家族遺傳史。試驗(yàn)前經(jīng)過醫(yī)院體檢，健康狀況均為良好，對(duì)香菇多糖無過敏癥狀。按照性別和專業(yè)均衡，將100名體育系大學(xué)生分為2組，每組50人，分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。要求試驗(yàn)期間，試驗(yàn)組學(xué)生每天服用2次香菇多糖益生菌咀嚼片，每次服用6片，連續(xù)服用100 d。對(duì)照組服用不含香菇多糖和益生菌的咀嚼片，攝入量和服用時(shí)間與試驗(yàn)組保持一致。所有體育系大學(xué)生不服用任何其他藥物，并且遵守專業(yè)飲食專家的指導(dǎo)建議，合理控制飲食，并保持每日飲食結(jié)構(gòu)一致。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè)

試驗(yàn)期結(jié)束后5 d內(nèi)，采集所有體育系大學(xué)生的靜脈血和糞便3次。

體重指標(biāo)：記錄體育系大學(xué)生的初始體重和終末體重，計(jì)算體重減少量，分析體育系大學(xué)生體重的變化情況。血清指標(biāo)：將采集到的血液樣本凝固60 min，3 000 r·min-1離心分離 10 min，收集上層血清，平均分成2份，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中一份按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定人體胃泌素、胃動(dòng)素、IgA和IL-2的含量，另一份用來檢測(cè)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的含量。糞便pH測(cè)定：取新鮮糞便0.1 g，用1.0 mL蒸餾水溶解震蕩使其混合均勻。離心分離30min，試樣出現(xiàn)分層現(xiàn)象，取上層清液，用數(shù)顯pH計(jì)測(cè)其pH。糞便水分含量測(cè)定：取少量糞便放置于鼓風(fēng)干燥箱里烘干3 h，稱量前后的質(zhì)量，計(jì)算質(zhì)量變化，得出糞便含水量。糞便氨含量測(cè)定：采用納試劑分光光度法檢測(cè)糞便氨含量，取新鮮糞便0.1 g，向其加入吸收液5 mL，攪拌混合均勻后，再向其加入Ⅰ級(jí)水，使總?cè)莘e達(dá)到10 mL，用波長為425 nm的光照射該試樣適當(dāng)時(shí)間，然后用儀器測(cè)定該試樣的吸光度，從而計(jì)算出試樣中氨含量。短鏈脂肪酸含量測(cè)定：采用氣相色譜法，取干燥的糞便0.1 g，加入10.0 mL蒸餾水溶解，充分震蕩和攪拌，然后進(jìn)行分離處理，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心10 min，取適量（大于3 mL）試樣的上層清液，然后通過0.45 μm的濾膜過濾所取試樣，完成后，用取樣器取濾液3 mL，加入0.2 mL的50%H2SO4和2.0 mL乙醚，充分震蕩后，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心10 min，最后取上層溶液進(jìn)行氣相色譜分析。糞便主要菌落種類數(shù)量變化測(cè)定：取糞便0.1 g，然后用滅菌生理鹽水稀釋到適宜濃度并震蕩混合均勻，隨后取 50 μL 涂布于 LBS、MRS+NNLP、VRBDA、BEA培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌培養(yǎng)，條件37℃培養(yǎng) 24 h～48 h。分別檢測(cè)乳桿菌、腸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌，以顯微鏡鏡檢、革蘭氏染色等方法鑒定菌種類別，并對(duì)菌落計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得的數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 的形式表示。不同劑量的試驗(yàn)組間與對(duì)照組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，均采用方差分析的方法，按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 體重指標(biāo)

試驗(yàn)組和對(duì)照組人員試驗(yàn)期間必須保證身體狀況良好，飲食統(tǒng)一合理安排。對(duì)照組體育系大學(xué)生的體重變化為（-2.27±1.30） kg，試驗(yàn)組體育系大學(xué)生的體重?zé)o明顯變化（P＞0.05）。試驗(yàn)組人員的主觀調(diào)查結(jié)果顯示，消化和排便感覺明顯順暢，表明香菇多糖和益生菌咀嚼片的使用，有效促進(jìn)了體育系大學(xué)生的腸道蠕動(dòng)，改善了消化功能，達(dá)到了輕微減重的效果。

2.2 血清指標(biāo)

試驗(yàn)組和對(duì)照組的體育系大學(xué)生的血清中各指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，與空白對(duì)照組相比，試驗(yàn)組人員胃泌素和胃動(dòng)素表達(dá)水平顯著較高，說明實(shí)驗(yàn)組人員的腸胃消化功能更好；實(shí)驗(yàn)組人員IgA和IL-2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，巨噬細(xì)胞高于對(duì)照組，由于香菇多糖是一種生物調(diào)節(jié)劑，可以進(jìn)行人體的免疫調(diào)節(jié)，與益生菌聯(lián)合使用，通過促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，使得實(shí)驗(yàn)組人員腸道免疫功能更好，腸道功能更健康。

表1 體育系大學(xué)生血清指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 糞便指標(biāo)

2.3.1 糞便pH、水分含量和氨含量的結(jié)果分析

試驗(yàn)組和對(duì)照組的體育系大學(xué)生的糞便中氨含量、水分含量和pH見表2。

表2 體育系大學(xué)生糞便理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，試驗(yàn)組體育系大學(xué)生糞便pH明顯低于對(duì)照組，表明香菇多糖和益生菌結(jié)合使用時(shí)，能夠有效地促進(jìn)短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，從而使堿性物質(zhì)減少，所以能夠使腸道的pH降低。由于腸道內(nèi)的腐生菌生存環(huán)境pH較高，代謝旺盛，容易產(chǎn)生致癌物質(zhì)，因此服用香菇多糖益生菌咀嚼片能有預(yù)防腸道疾病的產(chǎn)生[6]。

試驗(yàn)組體育系大學(xué)生連續(xù)服用100 d香菇多糖益生菌咀嚼片后，糞便中的水含量同樣明顯低于對(duì)照組，結(jié)合2組大學(xué)生糞便的實(shí)際情況，對(duì)照組大學(xué)生的糞便相對(duì)較稀，實(shí)驗(yàn)組大學(xué)生糞便成型度較好，表明香菇多糖益生菌咀嚼片具有促進(jìn)糞便成型、促進(jìn)排便的作用。

試驗(yàn)組體育系大學(xué)生連續(xù)服用100 d香菇多糖益生菌咀嚼片后，糞便中的氨含量明顯低于對(duì)照組大學(xué)生，且P＜0.05，表明益生菌可以有效地抑制腸道里有害菌的繁殖和成長，增強(qiáng)腸道對(duì)蛋白質(zhì)的吸收利用，從而降低糞便中的氨含量。

2.3.2 腸道微生物含量的比較

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體育系大學(xué)生的腸道微生物含量檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 體育系大學(xué)生腸道微生物檢測(cè)結(jié)果

從表3可以看出，試驗(yàn)組體育系大學(xué)生糞便中乳桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量比對(duì)照組顯著升高，腸道內(nèi)有害菌落腸桿菌和腸球菌數(shù)量減少，表明實(shí)驗(yàn)組大學(xué)生的腸道菌落更加健康。植物乳桿菌C88作為益生菌，可以非?？焖俚卦谀c道內(nèi)定植，并且快速繁殖生長，從而使有益菌數(shù)量增加，導(dǎo)致有害菌數(shù)量減少；香菇多糖作為活性物質(zhì)，能夠有效提高人體免疫[7]，其調(diào)整腸道菌落的主要原因可能是通過增強(qiáng)機(jī)體部分免疫細(xì)胞的功能，創(chuàng)造了對(duì)雙歧桿菌等有益菌有利的生長繁殖環(huán)境，使其能夠快速繁殖成長。所以該益生菌咀嚼片對(duì)改善腸道菌落種類和數(shù)量具有非常顯著性效果。

3 結(jié)論

香菇作為名貴的藥食兼用菌，一直是食品科研的前沿?zé)狳c(diǎn)。隨著食品加工和處理技術(shù)的飛速發(fā)展，香菇多糖提取工藝得到了很大的改進(jìn)和提升，香菇被開發(fā)出更加廣泛的用途。由于運(yùn)動(dòng)員長期進(jìn)行大量的訓(xùn)練，保障運(yùn)動(dòng)員腸道的健康尤為重要。結(jié)合益生菌改善、治療腸道疾病的作用，本研究以香菇多糖為原材料，開發(fā)了一種香菇多糖益生菌咀嚼片。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有效促進(jìn)了體育系大學(xué)生的腸道蠕動(dòng)，能夠調(diào)節(jié)腸道免疫功能，改善腸道菌群，促使腸道功能更加健康，有效地避免日常的高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)胃腸道產(chǎn)生的應(yīng)激刺激，使得腸胃正常生理功能運(yùn)轉(zhuǎn)受損。