馬藝超 路 飛 馬鳳鳴 葛新宇

謝加豪1 何運(yùn)輝1 張士豪1 張佰清1(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，沈陽(yáng) 110866)(沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院2，沈陽(yáng) 110034)

苦蕎麥?zhǔn)且环N藥食同源的作物，能夠起到抗氧化、降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗癌、護(hù)肝、抗炎、抗過敏等功效[1]。苦蕎中含有大量的黃酮類物質(zhì)，同一品種的不同部位的黃酮含量差異較大。近幾年，對(duì)于苦蕎中黃酮類物質(zhì)及其抗氧化活性的研究成為關(guān)注的熱點(diǎn)，但是主要通過對(duì)苦蕎原料中生物活性成分提取后進(jìn)行研究，而活性成分提取主要使用有機(jī)溶劑提純[2-3]?？嗍w中黃酮有一部分是以結(jié)合態(tài)存在，通過單純的有機(jī)溶劑提取黃酮類物質(zhì)主要集中于對(duì)游離態(tài)抗氧化的研究，會(huì)低估苦蕎的整體抗氧化能力，國(guó)內(nèi)外只有少量研究將谷物中的結(jié)合態(tài)抗氧化物質(zhì)考慮在內(nèi)[4]。有研究表明，胃腸道消化等吸收代謝處理對(duì)黃酮類物質(zhì)的釋放及抗氧化活性也有顯著影響，黃酮類化合物在胃腸道消化過程中可能與蛋白質(zhì)酶相互作用，形成復(fù)合物改變二者的分子結(jié)構(gòu)特征、功能以及營(yíng)養(yǎng)特性，從而對(duì)抗氧化活性產(chǎn)生影響[5]。由于機(jī)體攝入食物后，生物活性成分會(huì)在胃腸道消化過程中發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，使一部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能夠被機(jī)體完全吸收[8]。因此采用體外模擬消化的方法研究食物中功能性成分的吸收會(huì)更接近人體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用情況。Baublis等[6]研究發(fā)現(xiàn)谷物在胃酸和胃腸消化酶作用下總抗氧化活性有顯著提高；趙旭等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，消化過程對(duì)谷物的酚類和黃酮類物質(zhì)具有顯著的影響。研究均認(rèn)為在評(píng)價(jià)谷物食品抗氧化活性時(shí)應(yīng)考慮胃腸道環(huán)境[9-10]。模擬體外消化的方法具有時(shí)間短、操作方便，成本較低等優(yōu)點(diǎn)。因此，通過該方法，可以更科學(xué)地判斷食物在體內(nèi)的抗氧化活性。

眾所周知，苦蕎必須經(jīng)過熱加工處理熟化后食用?？局剖强嗍w熱加工過程中的一種重要加工手段。研究表明，烤制后的苦蕎面包經(jīng)過胃腸消化后其黃酮類物質(zhì)的含量及抗氧化活性與原料差異較大[14]。本實(shí)驗(yàn)采用體外模擬人體胃腸消化方法，研究不同烤制溫度下的苦蕎面包在不同消化階段黃酮類物質(zhì)含量及抗氧化能力的變化。以期為科學(xué)評(píng)價(jià)人體對(duì)苦蕎面包的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎粉(全粉、芯粉、麩皮粉)：四川涼山苦蕎種植基地。選取涼山地區(qū)特有的“西蕎1號(hào)”，將干凈苦蕎原糧進(jìn)行破碎脫殼，脫殼后的苦蕎粗粉和蕎殼混合物進(jìn)入機(jī)械振動(dòng)篩，將苦蕎顆粒粉和苦蕎殼進(jìn)行分離，脫殼至苦蕎殼中不再有苦蕎胚乳?？嗍w籽粒除雜后進(jìn)入篩選機(jī)分離出麩皮和麥芯，然后經(jīng)過磨制的苦蕎精粉通過篩出得到苦蕎芯粉，最后剩余的麩皮經(jīng)篩出后磨制得到苦蕎麩皮粉，對(duì)未脫皮的苦蕎籽粒直接磨粉得到苦蕎全粉。所有的面粉均過60～80目的篩子。

胃蛋白酶(1∶3 000)、胰蛋白酶、無(wú)水乙醇(分析純)、鹽酸(分析純)、福林-酚試劑、無(wú)水乙酸鈉、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、總抗氧化能力試劑盒(ABTS法)：北京鼎國(guó)生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-F恒溫振蕩培養(yǎng)箱；UV-5100型紫外-可見分光光度計(jì)；CZ-PHS-3E酸度計(jì)；SB25-12DTN超聲波清洗機(jī)；SP21-318C酶標(biāo)儀；3K15型高速冷凍離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎樣品的制備

稱取苦蕎面粉50 g，小麥粉200 g，加入30 ℃的溫水100 mL，加入酵母粉5 g，鹽2 g，放入和面機(jī)中揉成面團(tuán)，然后將面團(tuán)切割成每份30 g，放于28 ℃下靜置5 min，然后將其放在相對(duì)濕度為70%的醒發(fā)箱中，發(fā)酵約1.5 h，然后分別在160、180和200 ℃下烤制40min，制成苦蕎全面包、苦蕎芯面包和苦蕎皮面包，冷凍干燥后將其在粉碎機(jī)中粉碎成粉末，在-4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 體外模擬胃消化[11]

稱取800 mg苦蕎粉用100 mL 0.9% NaCl溶液溶解，加入0.5 mL 1 mol/L HCl溶液(此時(shí)混合液pH=1.5)，隨后加入10 mL模擬胃液(160mg胃蛋白酶(1：3000)溶于生理鹽水中，用鹽水調(diào)pH=1.5)；胃酸對(duì)照組：用等體積的0.01mol/L HCl 代替胃蛋白酶消化液，pH=2；空白對(duì)照組：用等體積的生理鹽水代替模擬胃液，將混合液放置37 ℃用錫箔紙包好避光，在厭氧條件下振蕩培養(yǎng)2 h。各組于胃消化0、20、40、60、80、120 min取樣，離心，測(cè)定上清液黃酮含量和抗氧化活性。

1.3.3 體外模擬腸消化[12]

向經(jīng)過胃消化后的混合液中逐滴加入0.5 mol/L NaHCO3，調(diào)pH=7.5，隨后加入20 mL模擬腸液(V(2 mg/mL的胰蛋白酶液)：V(12 mg/mL的膽酸鹽)=12:6)，繼續(xù)在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中避光持續(xù)消化2 h(厭氧條件)。各組于腸消化0、0.5、1、1.5、2 h取樣，離心，測(cè)定上清液黃酮含量和抗氧化活性。

1.3.4 黃酮含量測(cè)定

1.3.4.1 提取液提取[13]

稱取樣品粉末 1.0 g放入 50 mL 錐形瓶中，加入30 mL 75% 的乙醇溶液，在40 ℃下超聲提取40 min，放入離心管內(nèi)，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液，重復(fù)操作一次，合并上清液，定容到 50 mL，得游離態(tài)黃酮提取液，待測(cè)。向離心后的沉淀物中加入 2 mol/L NaOH 室溫避光渦旋1 min，混勻后超聲提取1 h，在氮?dú)鈼l件下，調(diào)pH至中性，再加入乙酸乙酯 20 mL振蕩5 min，4 000 r/min離心 10 min，取上清液，重復(fù)操作3次，合并上清液，定容 50 mL，得結(jié)合態(tài)黃酮提取液，待測(cè)。

1.3.4.2 黃酮的測(cè)定[14-15]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：精確量取濃度 200 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入75%的乙醇溶液5、4.8、4.6、4.2、3.8、3.4、3 mL，然后加5% 亞硝酸鈉 0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，再加10%硝酸鋁 0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，加4%氫氧化鈉 4.0 mL，用75%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置 12 min。于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)濃度值為縱坐標(biāo)，以吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 0.007 1x+ 0.057 9(R2= 0.987 3)。

黃酮的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO3)3絡(luò)合法測(cè)定：1 mL樣品溶液與300 μL 5% NaNO2溶液反應(yīng)6 min，然后加入10% Al(NO3)3溶液300 μL再反應(yīng)6 min后，加入2 mL 4% NaOH溶液后用蒸餾水定容至 5 mL，反應(yīng) 15 min，510 nm處測(cè)其吸光值。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品中的總黃酮含量表示為mg/100 g。

1.3.5 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.5.1 ABTS測(cè)定[16]

將ABTS用蒸餾水配制成2 mmol/L溶液，取50 mL溶液與200 mL K2S2O8水溶液 (70 mmol/L)混合均勻，避光放置12～16 h，得ABTS+·溶液。用磷酸鹽緩沖稀釋其至吸光度為0.70±0.02(A734nm)。然后將0.5 mL的樣品和2.5 mL的ABTS+·工作液混合均勻于30 ℃下孵育6 min，孵育結(jié)束后在30 ℃、745 nm條件下測(cè)定其吸光值A(chǔ)1。以在相同條件下，0.5 mL甲醇和2.5 mL 的ABTS+·工作液的混合溶液的吸光值A(chǔ)2為對(duì)照。每個(gè)樣品對(duì)ABTS+·清除能力用公式進(jìn)行計(jì)算：

1.3.5.2 清除羥自由基的測(cè)定[17]

取1.0 mL濃度為1.865 mmol/L鄰二氮菲的無(wú)水乙醇溶液于帶塞試管中，分別加入濃度為0.2 mol/L的pH 7.4磷酸鹽緩沖液2 mL和1 mL不同濃度的樣品，充分混勻后加入1.0 mL濃度為1.865 mmol/L的FeSO4溶液，再次混勻后加入1.0 mL 0.03% H2O2，于37 ℃恒溫水浴，60 min后，在536 nm下分別測(cè)量吸光度值得As，以蒸餾水代替樣品作為空白組測(cè)吸光度值得Ab，以蒸餾水替代H2O2作為損傷組，測(cè)其吸光度值A(chǔ)n，抗氧化劑的羥自由基清除率按公式計(jì)算：

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS V 20.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)和相關(guān)性分析。采用Origin 7.5軟件作圖進(jìn)行擬合函數(shù)分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料粉中的成分含量

表1 苦蕎原料粉中的成分含量(干基)

苦蕎麥的不同部位的營(yíng)養(yǎng)成分含量不同，在苦蕎皮粉中脂肪含量較高，苦蕎芯粉中主要是淀粉含量較高?？嗍w皮粉中游離黃酮和結(jié)合黃酮含量較高，因而不同苦蕎粉經(jīng)過加工后，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同，在人體的吸收也具有差異性。

2.2 黃酮類化合物的釋放量分析

體外模擬胃消化過程中，苦蕎面包中游離態(tài)黃酮和結(jié)合態(tài)黃酮釋放量的變化情況如圖1所示，與模擬胃消化0 h相比，苦蕎全、芯、皮面包的游離態(tài)黃酮釋放量在40 min內(nèi)顯著升高。模擬胃消化的2 h過程中，苦蕎全、芯和皮面包的游離態(tài)黃酮最大釋放量分別是胃消化0 h的1.282、1.297、1.417倍。這與王慧清等[24]在全麥粉模擬消化過程中的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，在160、180和200 ℃下烤制的3種苦蕎面包的黃酮類化合物的釋放量的增長(zhǎng)趨勢(shì)相似。180 ℃烤制下的苦蕎面包的黃酮含量雖然起始含量較高，但是在胃消化過程中的釋放量增長(zhǎng)率較低。黃酮類物質(zhì)對(duì)熱敏感，加熱過程中可能會(huì)使結(jié)合態(tài)黃酮增多，使游離態(tài)黃酮的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這間接促使游離態(tài)黃酮的消化吸收率增加。黃酮釋放量的增加可能是，苦蕎面包在胃消化過程中會(huì)受到胃蛋白酶的作用，將與黃酮類物質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)水解成小分子多肽，從而使被蛋白質(zhì)包裹的結(jié)合態(tài)黃酮分離釋放出來。Crespy等[18]研究表明，在胃消化過程中，游離的黃酮糖苷能夠在胃中吸收，而結(jié)合的黃酮糖苷則吸收較少。這可能是結(jié)合態(tài)黃酮在胃消化過程釋放量比游離態(tài)黃酮少的原因。

體外模擬腸消化過程中苦蕎面包的黃酮釋放量變化情況如圖2所示。與模擬腸消化0 h相比，苦蕎面包的黃酮釋放量在0.5 h后趨于穩(wěn)定，其中結(jié)合態(tài)黃酮釋放量的增長(zhǎng)率為61.45%～194.55%，顯著高于游離態(tài)黃酮的增長(zhǎng)率28.98%～44.35%。這可能是由于苦蕎中淀粉和蛋白質(zhì)的含量較高，胰酶中的胰蛋白酶能夠促使與結(jié)合黃酮相互作用的蛋白質(zhì)上的羧基斷裂，胰淀粉酶能夠水解淀粉中的α-1,4糖苷鍵，從而促進(jìn)了結(jié)合態(tài)黃酮的水解，使其釋放量顯著增加。

2.3 體外消化過程中苦蕎面包的抗氧化活性分析

2.3.1 體外消化過程中ABTS的分析

苦蕎全、芯、皮面包的在胃腸消化中ABTS+·清除率結(jié)果如圖3所示。在胃消化階段，苦蕎面包的抗氧化能力隨消化時(shí)間逐漸增加，與模擬胃消化0 h相比，苦蕎面包的ABTS值在40 min后趨于穩(wěn)定?？嗍w全面包、芯面包和皮面包在胃消化階段的ABTS最大增長(zhǎng)率分別為14.94%、16.19%和13.27%。與模擬消化0 h相比，苦蕎面包的ABTS值在0.5 h內(nèi)顯著增加。在腸消化的2 h內(nèi)，苦蕎全面包、芯面包和皮面包在180 ℃下釋放量增加的最多。研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎面包在烤制180 ℃下呈現(xiàn)出來的抗氧化能力較強(qiáng)，但是在180 ℃下烤制苦蕎面包的抗氧化能力，在消化中的增長(zhǎng)率比160 ℃和200 ℃的低。由于黃酮類物質(zhì)是天然的抗氧化劑，苦蕎面包的抗氧化能力在體外消化過程中的變化趨勢(shì)與黃酮類物質(zhì)大致相似。黃酮類物質(zhì)在消化中釋放量顯著增加，因此苦蕎面包的ABTS值也隨之顯著增加。

2.3.2 ·OH清除能力

苦蕎全面包、苦蕎芯面包、苦蕎皮面包的羥自由基清除能力測(cè)定的研究如圖4所示。在胃消化階段，苦蕎面包的羥自由基清除能力在消化時(shí)間60 min之前增長(zhǎng)較快，而在60 min后趨于穩(wěn)定。3種苦蕎面包在180 ℃下的·OH清除率比160、200 ℃的高，但是胃消化過程中的·OH清除率最大增長(zhǎng)率分別為：苦蕎全面包在200 ℃下為15.73%，苦蕎芯面包在200 ℃下為16.20%，苦蕎皮面包在160 ℃下為13.38%。由此表明，雖然180 ℃烤制下的苦蕎面包原始抗氧化能力較強(qiáng)，但在胃消化過程中增長(zhǎng)不明顯。在腸消化階段，0.5 h之前抗氧化活性增加，0.5 h后清除率趨于平穩(wěn)。苦蕎全面包、芯面包和皮面包在胃腸消化之后的·OH清除能力的變化趨勢(shì)跟游離態(tài)黃酮類化合物的變化趨勢(shì)相似。黃酮類化合物的存在形式，取代基的數(shù)量和位置等都會(huì)影響抗氧化能力。

2.4 苦蕎面包體外消化過程中黃酮類物質(zhì)釋放量動(dòng)力學(xué)分析

在模擬胃腸消化的過程中，發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)的釋放量與消化時(shí)間存在顯著的相關(guān)關(guān)系，對(duì)不同消化階段，游離態(tài)黃酮和結(jié)合態(tài)黃酮的釋放量，在不同的消化時(shí)間下進(jìn)行函數(shù)擬合，能夠更加直觀的分析黃酮類物質(zhì)隨消化時(shí)間的變化趨勢(shì)。通過對(duì)苦蕎面包在胃腸消化過程中黃酮釋放量的動(dòng)力學(xué)變化分析，發(fā)現(xiàn)胃消化過程中游離態(tài)黃酮釋放量隨消化時(shí)間的變化趨勢(shì)符合指數(shù)函數(shù)模型Y=aln(x)+b，胃消化過程中結(jié)合態(tài)黃酮的釋放量隨消化時(shí)間的變化趨勢(shì)符合冪函數(shù)模型Y=aXb，胃消化階段的黃酮類物質(zhì)釋放量的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。而腸消化過程中黃酮釋放量與消化時(shí)間的變化規(guī)律擬合度較低，R值均在0.85以下，苦蕎面包在腸消化0.5 h后黃酮釋放量均趨于穩(wěn)定狀態(tài)。由表2可知，苦蕎三種面包的消化速率大致相似。由于苦蕎中游離態(tài)黃酮和結(jié)合態(tài)黃酮的存在形式不同，與蛋白質(zhì)、淀粉等基本營(yíng)養(yǎng)成分的相互作用不同，從而使得在消化的起始階段游離態(tài)黃酮釋放量速率要高于結(jié)合態(tài)黃酮，但在消

表2 體外消化過程中酚類物質(zhì)釋放量變化動(dòng)力學(xué)參數(shù)

化后期結(jié)合態(tài)黃酮釋放量速率要高于游離態(tài)，可能是由于結(jié)合態(tài)黃酮需要在酶的作用下將與之結(jié)合的蛋白質(zhì)分解成小分子才能夠釋放出來。

2.5 體外消化過程中黃酮類物質(zhì)釋放量與抗氧化活性相關(guān)性分析

苦蕎面包中游離態(tài)黃酮和結(jié)合態(tài)黃酮與抗氧化活性的相關(guān)性分析見表3。黃酮類物質(zhì)的釋放量越高，其抗氧化活性也隨之增加。但黃酮類物質(zhì)的含量并不能夠代表樣品中化合物之間的協(xié)同和拮抗作用，相關(guān)關(guān)系數(shù)之間的差異，能夠間接反映出消化過程中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生了變化[22]。游離黃酮與ABTS+·和·OH清除能力具有正相關(guān)性，而結(jié)合黃酮與抗氧化能力的相關(guān)性較差。其中結(jié)合黃酮與ABTS+·清除能力不具有顯著的線性關(guān)系。對(duì)小扁豆的抗氧化活性研究表明，消化液中的酚類物質(zhì)與抗氧化活性有相關(guān)性，且不同抗氧化體系的相關(guān)程度不同[23]，與本研究結(jié)果具有相似性。

表3 黃酮含量與抗氧化性的相關(guān)性

注：*為顯著影響，P<0.05； **為極顯著影響，P<0.01。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬消化法，對(duì)不同溫度下烤制的3種苦蕎面包的黃酮含量及抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：3種苦蕎面包在胃腸消化過程中黃酮類物質(zhì)的釋放量均顯著增加，同時(shí)胃消化過程中游離態(tài)黃酮釋放量符合指數(shù)函數(shù)模型，結(jié)合態(tài)符合冪函數(shù)模型。在抗氧化活性測(cè)定中，胃腸消化過程中苦蕎面包的ABTS+·清除率和·OH清除率都顯著增加。同時(shí)，兩者與黃酮類物質(zhì)釋放量呈現(xiàn)正相關(guān)性。在前期研究烤制對(duì)苦蕎面包影響的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，烤制溫度在180 ℃時(shí)，苦蕎中的黃酮類物質(zhì)被極大程度的保留下來，但是在體外模擬消化過程中，在160 ℃烤制下的苦蕎面包的黃酮釋放量增長(zhǎng)較高。由此可以推測(cè)，苦蕎面包經(jīng)過人體消化后抗氧化活性增加，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。