伏二偉 馬曉軍 吳 燕 桑學(xué)財(cái)

(江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122)

小麥面筋蛋白又稱谷朊蛋白，主要成分為麥谷蛋白和麥醇溶蛋白，麥谷蛋白主要賦予面團(tuán)抗延伸性，麥醇溶蛋白主要賦予面團(tuán)黏合性[1]，基于這種特性，使得面筋蛋白除對(duì)面制食品品質(zhì)有重大影響外，還可用于制備纖維及蛋白膜等。谷朊纖維和谷朊蛋白膜制備過(guò)程中，麥醇溶蛋白和麥谷蛋白共混液的結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)和非牛頓指數(shù)對(duì)其制備工藝和產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響[2-3]。結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)(η)，表示共混液的結(jié)構(gòu)化程度，η越大，表示共混液的結(jié)構(gòu)化程度越高，成絲及成膜性越差；非牛頓指數(shù)(n)，表示流體偏離牛頓流動(dòng)行為的程度。對(duì)于假塑性流體，提高n可以使共混液的流動(dòng)特性更加接近于牛頓流體，有利于谷朊蛋白纖維和谷朊蛋白膜的制備。單寧酸是一種植物多酚類物質(zhì)，可以與蛋白質(zhì)的某些氨基酸(如賴氨酸，精氨酸和組氨酸)的氨基形成C—N共價(jià)鍵而發(fā)生交聯(lián)作用[4]，從而提高蛋白質(zhì)基質(zhì)的機(jī)械性能和水阻隔性能，由此可以推測(cè)，單寧酸對(duì)面筋蛋白性質(zhì)也同樣會(huì)有重要影響，但目前相關(guān)研究很少。

麥谷蛋白因其分子量較大，不適合進(jìn)行交聯(lián)處理，因此本研究采用單寧酸對(duì)麥醇溶蛋白進(jìn)行交聯(lián)，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單寧酸與麥醇溶蛋白交聯(lián)后對(duì)麥醇溶蛋白與麥谷蛋白共混液的流變性能影響很大，直接影響到在紡絲和制膜中的應(yīng)用，目前谷朊蛋白深加工才剛起步，相關(guān)研究報(bào)道很少。因此，研究麥醇溶蛋白的單寧酸交聯(lián)對(duì)谷朊蛋白的深加工利用具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究通過(guò)正交分析方法，研究蛋白濃度、單寧酸添加量、溫度、時(shí)間和pH這5個(gè)因素對(duì)麥醇溶蛋白交聯(lián)度的影響，確定了最佳交聯(lián)工藝條件，并進(jìn)一步研究了不同交聯(lián)程度對(duì)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液流變性能的影響，為谷朊蛋白纖維和谷朊蛋白膜的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要原料與儀器

谷朊粉、無(wú)水乙醇、尿素、亞硫酸鈉、單寧酸、2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)。

AR旋轉(zhuǎn)流變儀；FE20型pH計(jì)；高速攪拌機(jī)；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；ACPHA1-4型冷凍干燥機(jī)；DFT-100型粉碎機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取

麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取在參考文獻(xiàn)[5]的方法上略作改動(dòng)。麥醇溶蛋白的提?。簩⒐入梅酆?5%乙醇溶液以1∶30的料液比混合，50 ℃下振蕩提取3 h，離心分離，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥后得到麥醇溶蛋白。麥谷蛋白的提?。簩⑻崛←湸既艿鞍缀蟮某恋砗退?∶15的料液比混合，調(diào)節(jié)pH為11.5，60 ℃下振蕩提取3 h，離心分離，向上清液中添加無(wú)水乙醇，配制成65%乙醇溶液，并調(diào)節(jié)pH為7，4 ℃下過(guò)夜后離心，沉淀用蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥后得到麥谷蛋白。

1.2.2 單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白程度的測(cè)定

TNBS法：根據(jù)文獻(xiàn)[6,7]，取10 mg反應(yīng)后的麥醇溶蛋白于試管中，加入1 mL 4%的NaHCO3溶液(pH=8.5)和1 mL 0.1%的TNBS溶液，在40 ℃下避光反應(yīng)2 h后加入1 mL 10%的SDS和0.5 mL 1 mol/L的HCl溶液，在415 nm下測(cè)其吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次取平均值，空白樣將1 mL共混液換成蒸餾水，其他步驟同上。麥醇溶蛋白交聯(lián)度計(jì)算公式如下：

1.2.3 單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白工藝的研究1.2.3.1 單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白工藝

(1)麥醇溶蛋白濃度對(duì)交聯(lián)度的影響

將麥醇溶蛋白分散在適量蒸餾水中，加入20 mL交聯(lián)劑單寧酸溶液(20 g/L)，并將蛋白濃度分別調(diào)至1%、3%、5%、7%、10%，調(diào)節(jié)pH為10并保持穩(wěn)定，40 ℃條件下反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束將pH調(diào)為7.0，4 500 r/min下離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥，采用1.2.2方法測(cè)其交聯(lián)度。

(2)單寧酸添加量對(duì)交聯(lián)度的影響

將麥醇溶蛋白分散在適量蒸餾水中，分別加入2.5、5、10、15、20、25 mL的交聯(lián)劑單寧酸溶液(20 g/L)，并將蛋白濃度調(diào)至5%，調(diào)節(jié)pH為10并保持穩(wěn)定，40 ℃條件下反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束將pH調(diào)為7.0，4 500 r/min下離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥，采用1.2.2方法測(cè)其交聯(lián)度。

(3)溫度對(duì)交聯(lián)度的影響

將麥醇溶蛋白分散在適量蒸餾水中，加入20 mL交聯(lián)劑單寧酸溶液(20 g/L)，并將蛋白濃度調(diào)至5%，調(diào)節(jié)pH為10并保持穩(wěn)定，分別在30、35、40、45、50、55 ℃下反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束將pH調(diào)為7.0，4 500 r/min下離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥，采用1.2.2方法測(cè)其交聯(lián)度。

(4)時(shí)間對(duì)交聯(lián)度的影響

將麥醇溶蛋白分散在適量蒸餾水中，加入20 mL交聯(lián)劑單寧酸溶液(20 g/L)，并將蛋白濃度調(diào)至5%，調(diào)節(jié)pH為10并保持穩(wěn)定，40 ℃下分別反應(yīng)0.5、5、12、24、48 h，反應(yīng)結(jié)束將pH調(diào)為7.0，4 500 r/min下離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥，采用1.2.2方法測(cè)其交聯(lián)度。

(5)pH值對(duì)交聯(lián)度的影響

將麥醇溶蛋白分散在適量蒸餾水中，加入20 mL交聯(lián)劑單寧酸溶液(20 g/L)，并將蛋白濃度調(diào)至5%，分別調(diào)節(jié)pH至9.5、10、10.5、11、11.5并保持穩(wěn)定，40 ℃條件下反應(yīng)12 h，反應(yīng)結(jié)束將pH調(diào)為7.0，4 500 r/min下離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥，采用1.2.2方法測(cè)其交聯(lián)度。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化單寧酸交聯(lián)醇溶蛋白工藝

在單因素基礎(chǔ)上，采用五因素四水平，按L16(45)法進(jìn)行單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白正交實(shí)驗(yàn)，各因素及水平設(shè)計(jì)如表1，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4 單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液的配制

按照參考文獻(xiàn)[8]的方法略作修改，分別配制不同交聯(lián)度麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混溶液，麥谷蛋白與麥醇溶蛋白以1∶1比例混合，并將蛋白質(zhì)濃度調(diào)至13%，靜置待用。

1.2.5 單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液流變性能的測(cè)定

采用旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)定不同交聯(lián)度的麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混溶液的流變性能。旋轉(zhuǎn)流變儀所用的夾具為編號(hào)987882椎板，剪切速率為1～100 rad/s。非牛頓指數(shù)n：作lgτlgγ流動(dòng)曲線圖，圖線的斜率dlgτ/dlgγ即為n值；結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)η：作lgηγ1/2流動(dòng)曲線圖，η=-(dlgη/dγ1/2)×102，由圖lgηγ1/2的斜率即可求得η。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 不同因素對(duì)交聯(lián)度的影響

由圖1可知，麥醇溶蛋白的交聯(lián)度隨著蛋白濃度的增加而減小，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?%時(shí)，交聯(lián)度達(dá)到峰值，為21.45%。隨著蛋白濃度的提高，單位體積內(nèi)麥醇溶蛋白分子數(shù)目增多，分子間碰撞幾率增大，因此，麥醇溶蛋白交聯(lián)度提高；當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到5%之后，麥醇溶蛋白的交聯(lián)度開(kāi)始減小，這可能是因?yàn)榈鞍诐舛冗^(guò)大，麥醇溶蛋白分子鏈活動(dòng)空間變小，不利于蛋白分子間碰撞[9]，因此麥醇溶蛋白的交聯(lián)度減小。

圖1 不同因素對(duì)交聯(lián)度的影響

麥醇溶蛋白的交聯(lián)度隨著單寧酸添加量的增加而增大，當(dāng)單寧酸添加量為100 mg/g時(shí)，交聯(lián)度達(dá)到最大，為21.29%。這可能是因?yàn)樵诔跏茧A段，隨著單寧酸添加量的增加，分子間碰撞幾率增大，反應(yīng)速率提高，從而使得麥醇溶蛋白的交聯(lián)度增大；但隨著單寧酸添加量的繼續(xù)增加，可交聯(lián)的游離氨基都基本參與了反應(yīng)[9-10]，或者是過(guò)多交聯(lián)劑進(jìn)行自身的聚合反應(yīng)，不再參與麥醇溶蛋白的交聯(lián)反應(yīng)，從而影響反應(yīng)速率的提高，反應(yīng)達(dá)到飽和,使得麥醇溶蛋白的交聯(lián)度趨于平緩。

麥醇溶蛋白的交聯(lián)度隨著溫度的增加而增大，45 ℃后增幅開(kāi)始減小，且在溫度為55 ℃時(shí)，交聯(lián)度達(dá)到最大值22.16%。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，麥醇溶蛋白分子熱運(yùn)動(dòng)劇烈，分子間碰撞幾率增大[9]，從而使得交聯(lián)度增大；但當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃后，隨著溫度的繼續(xù)提高，參與反應(yīng)的氨基逐漸減少，反應(yīng)位點(diǎn)迅速消耗并趨于飽和[11]，最終導(dǎo)致反應(yīng)速率減小，麥醇溶蛋白交聯(lián)程度趨于平緩。

麥醇溶蛋白的交聯(lián)度隨著時(shí)間的增大而增大，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間在12 h后，曲線的增幅較5～12 h開(kāi)始減小，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為48 h時(shí)，交聯(lián)度達(dá)到最大，為22.15%。這可能是因?yàn)樵诔跏茧A段，反應(yīng)速率較慢，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，麥醇溶蛋白與單寧酸的接觸時(shí)間變長(zhǎng)，交聯(lián)度提高[9]；12 h后，時(shí)間越長(zhǎng)，可參與反應(yīng)的游離氨基的數(shù)目越來(lái)越少，因此麥醇溶蛋白的交聯(lián)程度增幅出現(xiàn)減小的趨勢(shì)。

pH值也是影響反應(yīng)速率的一個(gè)重要因素，由圖可以看出，隨著pH值的增加，交聯(lián)度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，并在pH=10.5時(shí)達(dá)到最大值22.89%。這是由于在堿性條件下，酚類化合物容易被氧化成醌中間體，更容易與蛋白鏈中的某些氨基酸基團(tuán)發(fā)生親核反應(yīng)[12-14]，形成C—N共價(jià)鍵，并產(chǎn)生交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[15]，但當(dāng)pH持續(xù)升高時(shí)，由于在強(qiáng)堿條件下，蛋白分子和單寧酸分子同時(shí)帶上負(fù)電荷，兩者相互排斥，親核反應(yīng)難以進(jìn)行，從而使得交聯(lián)度下降。

2.2 單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白工藝優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取A(麥醇溶蛋白濃度)3%、5%、7%、10%；B(單寧酸添加量)40、60、80、100 mg/g；C(溫度)40、45、50、55 ℃；D(時(shí)間)5、12、24、48 h；E(pH)10、10.5、11、11.5設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束將pH調(diào)為7.0，4 500 r/min下離心20 min，將沉淀用蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥。

由表2可知，各因素對(duì)麥醇溶蛋白交聯(lián)度的影響次序?yàn)椋旱鞍诐舛?時(shí)間>溫度>單寧酸添加量>pH，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出的最優(yōu)工藝條件為：蛋白濃度7%，單寧酸添加量60 mg/g，反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，pH為10，此時(shí)，麥醇溶蛋白的交聯(lián)度為(26.59±0.38)%；由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：交聯(lián)度在蛋白濃度5%和pH 10.5之后，出現(xiàn)減小的趨勢(shì)，在單寧酸添加量60 mg/g，交聯(lián)溫度45 ℃，交聯(lián)時(shí)間12 h后增幅減小，當(dāng)在蛋白濃度5%，單寧酸添加量60 mg/g，溫度45 ℃，時(shí)間12 h，pH 10.5條件下時(shí)，得到交聯(lián)麥醇溶蛋白的交聯(lián)度為(25.43±0.54)%。選擇麥醇溶蛋白交聯(lián)程度較高的幾個(gè)點(diǎn)：(23.78±0.74)%、(24.06±0.62)%、(24.73±0.35)%、(25.43±0.54)%、(26.08±0.35)%和(26.59±0.38)%，分析交聯(lián)前后麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液非牛頓指數(shù)和結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)的變化趨勢(shì)，為后期紡絲和制膜工藝提供理論基礎(chǔ)。

2.3 不同交聯(lián)程度麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液流變性能的研究

圖2為不同交聯(lián)度下的lgτlgγ圖，對(duì)圖2的lgτlgγ流動(dòng)曲線進(jìn)行一次線性擬合，可求得各流動(dòng)曲線線性方程斜率dlgτ/dlgγ，即為n值，求得的n值與交聯(lián)度的關(guān)系如表3所示。由圖2可知，共混液的剪切應(yīng)力隨著剪切速率的增大而增大，相同剪切速率下，剪切應(yīng)力隨著交聯(lián)度的增大而減小，這說(shuō)明隨著交聯(lián)度的增加，共混液的黏度減小。由表3中數(shù)據(jù)可知，不同交聯(lián)程度的麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液的非牛頓指數(shù)均小于1，都屬于非牛頓流體，且隨著交聯(lián)度的增大，n值不斷增大，這可能是因?yàn)殡S著麥醇溶蛋白交聯(lián)度的增大，交聯(lián)麥醇溶蛋白和麥谷蛋白纏結(jié)幾率變小[16]，從而使得共混液的黏度降低。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，后期共混液還要進(jìn)行其他工藝處理，處理后結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)和非牛頓指數(shù)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，因此前期應(yīng)控制共混液的非牛頓指數(shù)在0.75～0.90之間，且在這區(qū)間內(nèi)，非牛頓指數(shù)越小，紡絲和成膜過(guò)程越順暢，形成纖維和膜的能力也越強(qiáng)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖2 不同交聯(lián)度下的lgτlgγ圖

圖3為不同交聯(lián)度下的lgηγ1/2圖，對(duì)圖3的lgηγ1/2流動(dòng)曲線進(jìn)行一次線性擬合，結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)η=-(dlgη/dγ1/2)×102，由圖lgηγ1/2的斜率即可求得η，求得的η值與交聯(lián)度的關(guān)系如表3所示。由圖lgηγ1/2可知，共混液的表觀黏度隨著剪切速率的增大而減小，為剪切變稀型流體，且在同一剪切速率下，表觀黏度隨著交聯(lián)程度的增大而減小，這可能是因?yàn)殡S著剪切速率的增大，分子的支鏈順著剪切速率方向整齊排列，因而使得共混液的黏度減小[17-20]。也可能是因?yàn)?，隨著剪切速率的增加，大分子鏈段來(lái)不及松弛收縮而在流場(chǎng)中發(fā)生取向，取向后導(dǎo)致流層間的牽曳力減小，流暢阻力下降，也可使共混液黏度減小[21]。由表3可看出，結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)隨著交聯(lián)度的增大而不斷減小，這可能是因?yàn)殡S著麥醇溶蛋白交聯(lián)度的增大，麥醇溶蛋白與麥谷蛋白纏結(jié)幾率減小，導(dǎo)致共混液結(jié)構(gòu)化程度減小，紡絲和成膜性變好。結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)表征聚合物溶液的結(jié)構(gòu)化程度，可以衡量流體的可紡及成膜性[22]。結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)越大，說(shuō)明共混液的結(jié)構(gòu)化程度越高，可紡及成膜性越差，形成纖維及膜的質(zhì)量也越差[23]?？紤]到共混液的后續(xù)工藝處理，因此前期應(yīng)控制共混液的結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)在3.5～5.5之間，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在這區(qū)間內(nèi)，結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)越小，紡絲和成膜過(guò)程越易操作，且形成纖維和膜的能力也越強(qiáng)。

圖3 不同交聯(lián)度下的lgηγ1/2圖

表3 交聯(lián)度對(duì)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混

溶液結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)和非牛頓指數(shù)的影響

交聯(lián)度/%結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)非牛頓指數(shù)0.005.61±0.45d0.74±0.00a23.784.76±0.15c0.78±0.01b24.064.83±0.24c0.80±0.04b24.733.55±0.11b0.85±0.01cd25.433.50±0.18b0.84±0.02cd26.083.47±0.20a0.84±0.01c26.593.13±0.29b0.87±0.01c

由表3可看出，共混液的結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)隨著麥醇溶蛋白交聯(lián)程度的增大而減小，非牛頓指數(shù)隨著麥醇溶蛋白交聯(lián)度的增大而增大，共混液流變性能的這種變化趨勢(shì)改善了其成膜、纖維化等性質(zhì)。

3 結(jié)論

單寧酸交聯(lián)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液的流變性能是影響其紡絲和制膜工藝的重要因素，對(duì)麥醇溶蛋白進(jìn)行單寧酸交聯(lián)處理后，使得交聯(lián)麥醇溶蛋白/麥谷蛋白共混液的結(jié)構(gòu)黏度指數(shù)減小，非牛頓指數(shù)增大，這種變化改善了谷朊蛋白纖維和谷朊蛋白膜的制作工藝條件，有利于制備性能優(yōu)良的纖維及膜。