蔣新龍 郭葉瑩 吳小剛 陳品品 葉小霞 蔣益花

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015)

食用植物油中含有較多的不飽和脂肪酸，其中包括油酸(C18 ∶1)、亞油酸(C18 ∶2)以及亞麻酸(C18 ∶3)，在加工、儲(chǔ)藏以及銷售過程中極易出現(xiàn)氧化酸敗現(xiàn)象。油脂發(fā)生氧化所生成的氧化物不僅影響其營養(yǎng)價(jià)值、口感、風(fēng)味，且會(huì)對癌癥等多種疾病產(chǎn)生誘發(fā)作用[1-2]。延緩油脂氧化酸敗的一種有效方法是添加抗氧化劑[3-4]。

黃酮類化合物除具有通常的抗菌、抗癌、抗炎和抑制脂肪氧化酶等生物活性外[5-7]，還具有很強(qiáng)的抗氧化性，在油脂抗氧化方面有顯著效果[8-10]。但黃酮含有多個(gè)極性基團(tuán)，分子極性大，其親水性較強(qiáng)，故在油中的溶解度和界面分散性能不是很好，因此大大抑制了黃酮在抗油脂氧化中的應(yīng)用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃酮與磷脂之間具有特殊的親和力，通過制備磷脂復(fù)合物，可以提高黃酮的脂溶性[11]。本研究采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)，以槐花黃酮為原料制備黃酮磷脂復(fù)合物，利用正交設(shè)計(jì)對制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并初步探索黃酮磷脂復(fù)合物對植物油抗氧化的影響，旨在為槐花黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槐花：50 ℃鼓風(fēng)干燥72 h，粉碎過60目篩，備用；植物油為新鮮精煉核桃油和葡萄籽油；大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿98%)；蘆??；其他試劑均為分析純。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀、D8017TL-2H型格蘭仕微波爐、布魯克TENSOR27 紅外光譜儀、島津UV2450紫外可見分光光度計(jì)、UV-1600型紫外可見光譜儀、FW100 型高速萬能粉碎機(jī)、AB204-N 型分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槐花黃酮的制備和含量測定

槐花黃酮的制備：本實(shí)驗(yàn)室采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相的方法對槐花中黃酮進(jìn)行提取，并用大孔樹脂柱進(jìn)行純化。具體方法：以磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度117 mg· mL-1、54%乙醇溶液組合的乙醇-磷酸氫二鉀雙水相萃取體系，液料比60 ∶1(V/m)、微波提取時(shí)間30 s、微波功率為648 W等條件下，得到上相；將上相減壓濃縮得到的濃縮液調(diào)至pH值為6，過D-101大孔樹脂柱，用75%乙醇溶液洗脫，得到洗脫液，再對洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，冷凍干燥，得到純度高達(dá)90%的槐花黃酮，待用。

黃酮含量的測定：采用紫外分光光度法測定黃酮得率[12]，得到蘆丁質(zhì)量濃度C(mg· mL-1)與吸光度A之間的關(guān)系式為：A=28.289C+0.037 2，其線性范圍為0.00～0.10 mg· mL-1，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 7。待測樣品同法在360 nm處測定吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算黃酮含量。

1.2.2 黃酮磷脂復(fù)合物制備實(shí)驗(yàn)

制備方法：取一定量黃酮，置于100 mL 儀器專用萃取瓶中，加入適量無水乙醇配成一定黃酮質(zhì)量濃度，再按黃酮與磷脂的反應(yīng)投料比加入磷脂，攪拌使樣品良好分散于無水乙醇中。將萃取瓶放于儀器萃取爐腔中，安裝好冷凝回流裝置，分別設(shè)置微波功率、反應(yīng)時(shí)間等參數(shù)，檢查完畢后開啟微波及超聲(固定超聲條件：超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz，開啟超聲)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)一定時(shí)間后，減壓除去無水乙醇，再加入少量的三氯甲烷溶解其中的磷脂及復(fù)合物，溶解后進(jìn)行抽濾，滴加少量的三氯甲烷洗滌固體至只剩下未反應(yīng)的黃酮，收集沉淀，干燥后稱重W，同時(shí)濾液再次減壓干燥，蒸干所得物即為黃酮磷脂復(fù)合物。黃酮的初始投料量與沉淀量的差值即為與磷脂復(fù)合的黃酮的量，從而計(jì)算黃酮與磷脂的復(fù)合率。

式中：W0為黃酮初始投入量;W為黃酮沉淀量。

單因素實(shí)驗(yàn)：按照1.2.2提取方法，固定初始條件其他量不變，采用控制變量法，考量黃酮質(zhì)量濃度、投料比(磷脂與黃酮的質(zhì)量比)、反應(yīng)時(shí)間和微波功率等因素對復(fù)合率的影響。超聲條件固定(超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz)，分別設(shè)置投料比梯度2 ∶1、1 ∶1、1 ∶1.5、1 ∶2、1 ∶2.5；黃酮質(zhì)量濃度梯度1、2、3、4、5 mg/mL；反應(yīng)時(shí)間梯度10、20、30、35、40 min；微波功率梯度100、200、300、400、500 W。

正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇黃酮質(zhì)量濃度、反應(yīng)時(shí)間、微波功率、投料比4個(gè)因素為主要變量，以復(fù)合率為指標(biāo)，采用 L9(43)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.2.3 黃酮磷脂復(fù)合物的理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

紫外分析：將一定量的黃酮以及黃酮磷脂復(fù)合物分別溶于無水乙醇溶液中，制成一定濃度的乙醇溶液；同樣方法制備一定濃度的磷脂乙醇溶液，將3種溶液進(jìn)行紫外全波長掃描。

紅外分析：采用KBr壓片法分別對黃酮、磷脂及黃酮磷脂復(fù)合物在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

溶解度的測定：取20 mL溶劑(水、正辛醇)，分別加入過量的黃酮或黃酮磷脂復(fù)合物于室溫下攪拌6 h，取上清液過0.45 μm濾膜，測定其上清液濃度。

1.2.4 黃酮磷脂復(fù)合物對植物油抗氧化影響實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 黃酮磷脂復(fù)合物植物油樣品液的制備

參照 GB 2760—2014中一般在植物油脂中加入天然抗氧化劑用量，本實(shí)驗(yàn)黃酮磷脂復(fù)合物濃度梯度設(shè)置為 0.01%～0.06%。按設(shè)計(jì)所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)將適量的黃酮磷脂復(fù)合物添加到植物油中，先超聲輔助溶解10 min，再磁力攪拌10 min，使黃酮磷脂復(fù)合物與植物油充分混勻，得到系列黃酮磷脂復(fù)合物植物油樣。

用所得到的系列黃酮磷脂復(fù)合物植物油樣，以油脂的過氧化值為衡量指標(biāo)[13]，采用GB/T 5538—2005法測定過氧化值，先測定常溫下POV值，再測定98 ℃加熱 6 h 后POV值，根據(jù)加熱后過氧化值的相對大小，確定最佳添加量。

1.2.4.2 植物油表觀活化能測定

采用Schaal烘箱法[14]測定樣品POV隨貯藏溫度、時(shí)間的變化。將最佳黃酮磷脂復(fù)合物添加量的植物油置于碘量瓶中密封，分別置于45、55、65 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中。每隔2 d(共10 d)取樣，測定樣品POV0。

植物油的氧化符合一階動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[15,16]，在植物油中添加抗氧化劑后植物油的氧化也符合一階動(dòng)力學(xué)反應(yīng)[17]。本研究在根據(jù)一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程ln(POV/POV0)=-kt，對不同時(shí)間t的POV進(jìn)行擬合，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，求得反應(yīng)速率常數(shù)k。根據(jù)Arrhenius反應(yīng)速率k與溫度T的關(guān)系經(jīng)驗(yàn)公式(lnk=lnk0-Ea/RT)，用lnk對1/T作圖，可得到一條斜率為-Ea/R的直線，由斜率可得表觀活化能Ea[18]。同法空白參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法及分析軟件

以上指標(biāo)均重復(fù)測定3次并取平均值，應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用Ori gin8軟件作圖，用Duncan多重比較(SSR法)檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮磷脂復(fù)合物制備

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)張勝海[19]、石森林[20]等研究結(jié)果和本團(tuán)隊(duì)的預(yù)試結(jié)果，確定無水乙醇為反應(yīng)溶劑。

圖1可知，在磷脂 ∶槐花黃酮質(zhì)量比為2 ∶1時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。投料比對復(fù)合率有較大的影響，復(fù)合率隨體系中磷脂比例的增加而增加。當(dāng)磷脂 ∶槐花黃酮質(zhì)量比為2 ∶1時(shí)，二者的相互作用最充分。

在反應(yīng)物濃度為1～2 mg/mL時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率隨著黃酮濃度的增大而增大，當(dāng)反應(yīng)物濃度為2 mg/mL時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。黃酮濃度對復(fù)合率有較大影響，黃酮濃度較小時(shí)，復(fù)合率較高。因?yàn)辄S酮在溶液中須經(jīng)碰撞才能發(fā)生反應(yīng)，較高的濃度反而不利于反應(yīng)的進(jìn)行[21]。

在反應(yīng)時(shí)間為10～35 min時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)35 min時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率最高。反應(yīng)時(shí)間過長，微波的熱效應(yīng)會(huì)使黃酮產(chǎn)生降解。

在微波功率為300 W時(shí)，磷脂復(fù)合物的復(fù)合率達(dá)到最大值。超聲-微波協(xié)同技術(shù)的最的優(yōu)勢在于能同時(shí)充分利用微波的高能作用和熱效應(yīng)以及超聲波的空化作用。隨著微波功率的增加，磷脂分子和黃酮的熱力學(xué)活動(dòng)趨于活躍，有利于兩者之間的進(jìn)一步結(jié)合。但微波功率過高，高能熱效應(yīng)明顯，黃酮穩(wěn)定性較差，不利于黃酮磷脂復(fù)合物的形成。且溫度過高也不利于磷脂復(fù)合物的穩(wěn)定。

圖1 黃酮磷脂復(fù)合物制備條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表1為正交試驗(yàn)的因子與水平。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 4因子在3水平正交試驗(yàn)的因子與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

注：因素D影響小，故作為方差分析的誤差處理；F0.05(2、2)=19.00，“*”表示因素影響顯著。

表2中k1、k2、k3表示每個(gè)因素所進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)所得的復(fù)合率的平均值。R為平均數(shù)的極差，R越大表明變化幅度大，說明該因素的水平變化對復(fù)合率的影響越大，該因素即是最大影響因素。由表2極差可以看出影響復(fù)合率的因素主次依次排列為：黃酮質(zhì)量濃度(A)>投料比(B)>反應(yīng)時(shí)間(C)>微波功率(D)。由表3可以看出，對復(fù)合率的影響主次依次排列為：黃酮質(zhì)量濃度(A)>投料比(B)>反應(yīng)時(shí)間(C)>微波功率(D)。方差分析和極差分析在復(fù)合率影響主次排列上完全一致。表3還可以看出，對復(fù)合率的影響黃酮質(zhì)量濃度(A)和投料比(B)顯著，其他則不顯著。直觀分析，實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A2B2C3D1；根據(jù)每個(gè)因素k1、k2、k3實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合為A2B2C3D2。因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間40 min與35 min、30 min差異顯著，微波功率三個(gè)水平之間無顯著差異，綜合分析提取成本和復(fù)合率，確定最佳工藝條件A2B2C3D1，即黃酮質(zhì)量濃度2 mg/ mL，投料比1 ∶2 g/g，反應(yīng)時(shí)間40 min，微波功率200 W。根據(jù)最佳工藝條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，復(fù)合率為79.98%，與預(yù)測值無顯著差異。

2.2 理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 光譜分析

紫外掃描如圖2所示。黃酮在 265、370 nm處有強(qiáng)烈吸收峰，這是由于黃酮具有共軛不飽和結(jié)構(gòu)所致；卵磷脂沒有共軛結(jié)構(gòu)，以致卵磷脂只有在215 nm處有紫外最大吸收峰出現(xiàn)；黃酮-卵磷脂復(fù)合物與黃酮在紫外圖譜中沒有顯著差異，且它們均在 265、370 nm處有強(qiáng)烈吸收峰，與黃酮一致。由此可知，黃酮與卵磷脂在形成復(fù)合物的過程中沒有產(chǎn)生新的共軛結(jié)構(gòu)，它們僅僅是通過非共價(jià)結(jié)合。

圖2 紫外吸收光譜圖

圖3 紅外吸收光譜圖

由圖3可以知道，在黃酮的紅外圖譜中，約3 417 cm-1處代表的是羥基特征峰，隨后分別是羰基(1 647 cm-1)和苯環(huán)(1 516、1 286、1 196、1 132 cm-1)的特征吸收峰。黃酮和卵磷脂的復(fù)合物與黃酮的吸收光譜大致相同，黃酮和卵磷脂的特征吸收峰都可以在復(fù)合物的吸收光譜中找到，復(fù)合物的吸收光譜表現(xiàn)為黃酮和卵磷脂的吸收光譜的疊加。但黃酮在1 000～1 500 cm-1之間的大部分特征吸收特征峰變化比較大，表明黃酮和卵磷脂不是簡單的一種混合狀態(tài)，黃酮與卵磷脂發(fā)生了相互作用，但復(fù)合物在掃描范圍內(nèi)是沒有出現(xiàn)新的吸收峰。由此說明，黃酮和卵磷脂在形成復(fù)合物的過程中并沒有形成新的共價(jià)鍵，黃酮和卵磷脂在復(fù)合物中仍然各自保留其基本的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

由紅外、紫外光譜分析初步看出在復(fù)合物中并無新的化學(xué)鍵生成。黃酮與磷脂的復(fù)合是一種弱的相互作用[21]，從結(jié)構(gòu)上看，黃酮酚羥基上的氧具有負(fù)電性，磷脂帶有正電性的季胺氮，兩者可產(chǎn)生偶極-偶極作用力而使兩分子結(jié)合[22]，形成黃酮磷脂復(fù)合物。

2.2.2 溶解度測定結(jié)果

槐花黃酮是極性化合物，在油脂中的溶解性極低，而其與磷脂形成的包合物后在油脂中的溶解性可以得到提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮在 25 ℃正辛醇中的溶解度為 0.877 1 mg/mL；而黃酮卵磷脂復(fù)合物在正辛醇中的溶解度增加至5.582 7mg/mL，脂溶性增加了6.4倍，脂溶性得到顯著提高，可能是復(fù)合物中磷脂的極性基團(tuán)與黃酮相互作用而受到一定的掩蔽，使得復(fù)合物表現(xiàn)出較強(qiáng)的脂溶性[23]。黃酮在 25 ℃水中的溶解度為 0.026 9 mg/mL；而黃酮卵磷脂復(fù)合物在水中的溶解度增加至0.513 3 mg/mL，水溶性增加了19.1倍，水溶性也得到了很大改善，可能是由于其在水中形成的類似脂質(zhì)體的膠團(tuán)結(jié)構(gòu)的增溶作用[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磷脂復(fù)合物可改善黃酮的溶解性能。

圖4 槐花黃酮抗油脂氧化效果

2.3 槐花黃酮磷脂復(fù)合物對油樣的抗氧化效果

2.3.1 濃度對槐花黃酮磷脂復(fù)合物抗油脂氧化效果的影響

由圖4可知，添加槐花黃酮磷脂復(fù)合物后，葡萄籽油和核桃油的過氧化值均低于空白對照，說槐花黃酮磷脂復(fù)合物對葡萄籽油和核桃油具有抗氧化作用，且隨著其添加量的增加，植物油的過氧化值逐漸降低，抗氧化活性增強(qiáng)，對葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有劑量效應(yīng)的關(guān)系。

表4 植物油過氧化值的回歸方程及活化能參數(shù)

注：y為ln(POV /POV0)；x為t。

2.3.2 溫度對槐花黃酮磷脂復(fù)合物抗油脂氧化效果的影響

本研究采用抗油脂氧化效果最好的0.06%槐花黃酮磷脂復(fù)合物進(jìn)行Schaal烘箱加速氧化實(shí)驗(yàn)。圖5為兩種植物油抗氧化穩(wěn)定性在不同溫度、時(shí)間下的變化。由圖5可知，在45、55、65 ℃時(shí)，添加槐花黃酮磷脂復(fù)合物前后對葡萄籽油和核桃油的過氧化值變化趨勢大體相同。隨著溫度升高和加熱時(shí)間的延長，植物油的過氧化值逐漸升高，氧化速度加快。

圖5 植物油抗氧化穩(wěn)定性在不同溫度、時(shí)間下的變化

根據(jù)1.2.3.2方法得到過氧化值的回歸方程。由表4可知，植物油的氧化反應(yīng)屬于一級反應(yīng)，其回歸系數(shù)R>0.97，擬合度高，與周嬋玉等研究結(jié)果一致[17]。且隨著溫度升高，氧化速率增大。

根據(jù)1.2.3.2方法得到表觀活化能。表4可知，添加槐花黃酮磷脂復(fù)合物后植物油的活化能明顯升高，說明添加槐花黃酮磷脂復(fù)合物的植物油的氧化反應(yīng)較難進(jìn)行。由于槐花黃磷脂復(fù)合物所含的酚類結(jié)構(gòu)，可提供氫原子，使自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)態(tài)的化合物，進(jìn)而中斷自由基反應(yīng)[24]，提高了相應(yīng)植物油的抗氧化性。

表4同樣表明，核桃油表觀活化能增大百分率比葡萄籽油大，說明槐花黃酮磷脂復(fù)合物對核桃油的抗油脂氧化效果更有效，主要原因是跟核桃油與葡萄籽油含有不同的脂肪酸成分有關(guān)[25]。核桃油比葡萄籽油亞麻酸含量高，多不飽和脂肪酸含量比葡萄籽油高。有試驗(yàn)表明，亞麻酸含量對油脂氧化影響遠(yuǎn)大于亞油酸含量的影響，且亞麻酸氧化速度為亞油酸的兩倍[26]，含多不飽和脂肪酸油脂的氧化敏感性較高[25]。所以槐花黃酮磷脂復(fù)合物對核桃油的抗油脂氧化效果比葡萄籽油更有效。

3 結(jié)論

以槐花黃酮為原料，以復(fù)合率為衡量指標(biāo)，采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)制備黃酮磷脂復(fù)合物，利用正交設(shè)計(jì)對制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳制備工藝為：無水乙醇為反應(yīng)溶劑，磷脂與黃酮的投料比1 ∶2 g/g，黃酮質(zhì)量濃度2 mg/mL，微波功率200 W，反應(yīng)時(shí)間40 min，此制備條件下，黃酮磷脂復(fù)合物復(fù)合率為79.98%。

紅外光譜和紫外光譜分析表明，黃酮與卵磷脂在形成復(fù)合物的過程中沒有產(chǎn)生新的共軛結(jié)構(gòu)，它們僅僅是通過非共價(jià)結(jié)合。磷脂復(fù)合物可改善黃酮的溶解性能，水溶性增加了19.1倍，脂溶性增加了6.4倍。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槐花黃酮磷脂復(fù)合物對葡萄籽油和核桃油的抗氧化能力有劑量效應(yīng)的關(guān)系。在植物油中添加黃酮磷脂復(fù)合物后植物油的氧化符合一階動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。添加黃酮磷脂復(fù)合物后植物油的氧化反應(yīng)活化能較大，添加黃酮磷脂復(fù)合物可以延緩葡萄籽油和核桃油的氧化反應(yīng)。核桃油表觀活化能增大百分率比葡萄籽油大，槐花黃酮磷脂復(fù)合物對核桃油的抗油脂氧化效果更好。本研究為槐花黃酮的進(jìn)一步資源化開發(fā)利用提供了一定的技術(shù)支撐。