郭旭茜 韓雪 李研東 蔡英華 于雷 康牧旭 艾連峰

摘 要：獸藥殘留分析檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)與創(chuàng)新是動(dòng)物源性食品安全監(jiān)測(cè)的重要研究?jī)?nèi)容。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，代謝組學(xué)研究及其檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物源性食品安全領(lǐng)域發(fā)揮了不可或缺的作用?；诋?dāng)前代謝組學(xué)技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域的研究成果，闡述了代謝組學(xué)的概念、原理與分類;以“瘦肉精”和類固醇兩類違禁獸藥殘留檢測(cè)為例，簡(jiǎn)述了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry， LC-MS）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry， GC-MS）等代謝組學(xué)常用檢測(cè)技術(shù)對(duì)動(dòng)物血液、尿液等生物樣本進(jìn)行殘留分析檢測(cè)的應(yīng)用現(xiàn)狀，分析了非靶向代謝組學(xué)與靶向代謝組學(xué)存在的精確度差與通量低等問題，以及代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)大型儀器設(shè)備與專業(yè)數(shù)據(jù)庫過度依賴的局限性;進(jìn)一步提出了代謝組學(xué)技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)的應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)樣品特點(diǎn)及檢測(cè)目的，將多技術(shù)平臺(tái)（液相色譜-電噴霧飛行質(zhì)譜、超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜）、分析平臺(tái)（主成分分析、偏最小二乘判別分析）與多組學(xué)技術(shù)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)）聯(lián)合使用以提高代謝組學(xué)技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域的適用性與應(yīng)用范圍，為獸藥殘留分析檢測(cè)提供新的研究方向。

關(guān)鍵詞：食品檢驗(yàn)學(xué);代謝組學(xué);獸藥殘留;食品安全;檢測(cè)

中圖分類號(hào)：Q591.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-1542（2019）04-0359-07

近年來全球范圍內(nèi)食品安全事件層出不窮，對(duì)人類的身體健康以及食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了嚴(yán)重的不良影響，如新西蘭恒天然肉毒桿菌、巴西的“黑心肉”以及中國的瘦肉精、三聚氰胺事件等。在常規(guī)食品分析檢測(cè)中， 質(zhì)譜、光譜、色譜以及其他一些儀器分析方法對(duì)已知目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果是較準(zhǔn)確的[1]，但在某些特殊情況下，這些有針對(duì)性的方法不能檢測(cè)到該類物質(zhì)或新代謝產(chǎn)生的化合物[2-3]，且動(dòng)物源性食品的獸藥殘留檢測(cè)常存在獸藥殘留濃度較低，同時(shí)測(cè)定抗生素[4-5]、受體激動(dòng)劑[6]、類固醇[7]等不同性質(zhì)的獸藥會(huì)較困難等，因此亟需開發(fā)新型的檢測(cè)方法和策略來解決這一技術(shù)難題。

代謝組學(xué)（metabonomics）是研究受刺激或擾動(dòng)后的生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間變化的一門科學(xué)，目的是分析生物系統(tǒng)內(nèi)所有代謝物的含量[8]。1999年英國倫敦大學(xué)帝國學(xué)院的 NICHOLSON 教授首次定義了代謝組學(xué)[9]， 它與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)共同構(gòu)成了“系統(tǒng)生物學(xué)”[10]。代謝組學(xué)技術(shù)能從小分子的角度來分析生物體系，在目標(biāo)物質(zhì)的分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，近年來迅速發(fā)展并滲透到食品、中醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等多種領(lǐng)域，并發(fā)揮了不可替代的作用[11-12]。

代謝組學(xué)可以對(duì)已知的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析， 又能對(duì)未知化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分析，根據(jù)研究的目的和對(duì)象的不同，可分為靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué);靶向代謝組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)皆可用于研究獸藥的代謝機(jī)制，靶向代謝組學(xué)針對(duì)的是特定的某一類代謝物，用于少量目標(biāo)代謝物檢測(cè)，關(guān)注目標(biāo)通路代謝物，是絕對(duì)定性定量的，而非靶向代謝組學(xué)面對(duì)的是生物體內(nèi)源性的整體代謝物全面檢測(cè)，尋找潛在生物標(biāo)志物，其操作簡(jiǎn)單，且非靶向檢測(cè)代謝物通量高，發(fā)現(xiàn)新標(biāo)志物的幾率大。因此近些年來， 國內(nèi)外一些學(xué)者陸續(xù)將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域，例如檢測(cè)獸藥殘留，對(duì)摻假食品進(jìn)行分析鑒別[13-14]，檢測(cè)食品或食品包裝材料中的有害物質(zhì)[15]等，靶向和非靶向代謝組學(xué)技術(shù)可表達(dá)出生物標(biāo)志物與違禁添加的獸藥之間的關(guān)系， 從而可作為指示物為相關(guān)預(yù)警監(jiān)督提供一個(gè)平臺(tái)[2，16]。

代謝組學(xué)作為一種新型的藥物監(jiān)控檢測(cè)技術(shù)，可用來解決食品安全問題，為人類健康生活提供更好的保障。

通過總結(jié)、分析和討論代射組學(xué)在獸藥違規(guī)檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，為進(jìn)一步應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)、開展食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估提供一定的參考[17]。

1?瘦肉精及其代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析

瘦肉精，即克倫特羅（clenbuterol，CLE），屬于β-受體激動(dòng)劑，臨床上最初用來治療哮喘、阻塞性肺炎等疾病;與之作用機(jī)理相似的還有萊克多巴胺（ractopamine，RAC）、沙丁胺醇（salbuterol，SAL）、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅、鹽酸多巴胺等多種β-受體激動(dòng)劑類藥物，均可顯著提高胴體瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率[6]，近年來，包括中國在內(nèi)的許多國家都出現(xiàn)食用β-受體激動(dòng)劑殘留產(chǎn)品而發(fā)生食物中毒的事件。中國針對(duì)瘦肉精的檢測(cè)設(shè)置了一些標(biāo)準(zhǔn)，常用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）進(jìn)行動(dòng)物組織中沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅等殘留量的檢驗(yàn)[18-21]，但是常規(guī)檢測(cè)技術(shù)對(duì)某些禁用藥物的新化合物或者低劑量聯(lián)合使用往往無法檢測(cè)出來[22]，需進(jìn)行更嚴(yán)格的監(jiān)督檢測(cè)來保障動(dòng)物源食品安全，代謝組學(xué)技術(shù)可用來檢測(cè)這一類藥物的生物標(biāo)志物，進(jìn)而可有效幫助監(jiān)測(cè)該藥物的非法使用情況[22-31]。

近年來研究人員陸續(xù)將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于違規(guī)使用瘦肉精而殘留于動(dòng)物體內(nèi)的檢測(cè)，雖檢測(cè)過程有些不同，但皆證明了代謝組學(xué)技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)方面的可行性以及可靠性，例如以2-吲哚甲酸作為生物標(biāo)志物有助于對(duì)瘦肉精的濫用情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因?yàn)榉檬萑饩髣?dòng)物體內(nèi)代謝水平會(huì)發(fā)生變化，通過識(shí)別異常代謝物水平，可找出潛在的生物標(biāo)志物，對(duì)其進(jìn)一步鑒定分析后可幫助了解瘦肉精在動(dòng)物體內(nèi)詳細(xì)的代謝機(jī)制，進(jìn)而對(duì)瘦肉精的濫用情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)[28，30]，瘦肉精在牛體內(nèi)已知的主要代謝途徑如圖1所示[25]。

DERVILLY-PINEL等[23]研究β-受體激動(dòng)劑（β-agonists）對(duì)牛尿液代謝的影響，發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)技術(shù)可通過生物標(biāo)志物和統(tǒng)計(jì)模型來監(jiān)測(cè)動(dòng)物體內(nèi)是否使用β-受體激動(dòng)劑，并利用生物矩陣分析揭示藥物的生物效應(yīng);DOMNGUEZ-ROMERO等[24]利用液相色譜-電噴霧飛行質(zhì)譜法（liquid chromatography electrospray time-of-flight mass spectrometry，LC-TOF MS）檢測(cè)大鼠單次給藥后，克倫特羅、特布他林和沙丁胺醇的尿代謝產(chǎn)物情況，經(jīng)鑒定共發(fā)現(xiàn)11種代謝產(chǎn)物，其中有4種未出現(xiàn)在以前尿液報(bào)告中。

畢言鋒[25]應(yīng)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（ultra high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF MS）研究β-受體激動(dòng)劑在豬體內(nèi)的代謝規(guī)律， 在監(jiān)控苯乙醇胺A（phenyletiianolamine A，PEAA）非法使用時(shí)， 發(fā)現(xiàn)脫甲基代謝產(chǎn)物（demethylation-phenyletiianolamine A，DM-PEAA）更適合作為尿液和組織中的殘留檢測(cè)的目標(biāo)物，為選擇殘留檢測(cè)標(biāo)志物和建立殘留分析方法提供了一定參考;吳玉蘋[28]對(duì)使用β2-受體激動(dòng)劑的豬尿進(jìn)行分析，證實(shí)篩選出的共同差異代謝物2-吲哚甲酸和氟米龍醋酸酯在β2-受體激動(dòng)劑監(jiān)測(cè)的時(shí)效上是可行的;谷旭等[29]在豬尿液和血漿中檢測(cè)出5種沙丁胺醇的代謝產(chǎn)物，其中2種尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，血漿中僅檢測(cè)到原型藥物和2種代謝物;WU等[31]分析了服用由3種低劑量β2-激動(dòng)劑混合物組成的“雞尾酒”后豬尿液的特征，結(jié)果檢測(cè)到的2-吲哚甲酸和氟甲氧基乙酸生物標(biāo)志物無論是單次還是混合物都可作為檢測(cè)β2-激動(dòng)劑非法使用的診斷標(biāo)志物，證明了利用標(biāo)記物監(jiān)測(cè)β2-激動(dòng)劑是可行的。

2?類固醇及其代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析

類固醇激素，又稱甾體激素，蛋白質(zhì)同化作用強(qiáng)烈持久，能促進(jìn)動(dòng)物超常態(tài)生長(zhǎng)，可為養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，因而在養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用[9]。但是，濫用該類激素會(huì)導(dǎo)致在動(dòng)物組織中產(chǎn)生不同程度的殘留，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異常甚至存在潛在的致癌、致畸風(fēng)險(xiǎn)。外源性類固醇是已知的類固醇，如替尼博龍，包含合成化學(xué)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是非自然的，對(duì)其的檢測(cè)只需進(jìn)行定性的證明;內(nèi)源性類固醇，如睪酮，黃體酮，含有已知的自然存在的結(jié)構(gòu)，對(duì)其的檢測(cè)更為復(fù)雜。

中國設(shè)立的國家標(biāo)準(zhǔn)中常采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）檢測(cè)動(dòng)物源食品中激素的殘留量[32-34]，雖然在過去十年中，從氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）到液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS），藥物殘留分析技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)有了許多轉(zhuǎn)變，但GC-MS仍是分析飽和甾體代謝物的重要工具[35]，因?yàn)樵贚C-MS的電離條件下，飽和甾體化合物通常會(huì)受到電離性差的影響。高分辨率、高精度液相色譜質(zhì)譜（liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）可顯示出卓越的質(zhì)量穩(wěn)定性，可同時(shí)監(jiān)測(cè)大量分析物，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)或回溯性的監(jiān)測(cè)[36]。雖然沒有一種方法能夠檢測(cè)到所有物種中所有內(nèi)源性類固醇的濫用情況，但代謝組學(xué)技術(shù)在類固醇監(jiān)測(cè)領(lǐng)域內(nèi)已取得了重大進(jìn)展[37-46]，類固醇類激素的代謝通路如圖2所示[47]。

DERVILLY-PINEL等[37]研究發(fā)現(xiàn)了類固醇給藥后動(dòng)物尿液中代謝組的改變狀況，此研究突出了對(duì)生物標(biāo)志物的針對(duì)性監(jiān)測(cè)，可為合成代謝類固醇藥物的篩選開辟新的研究思路;NZOUGHET等[38]利用LC-HRMS方法，首次以血清為樣本類型，研究服用雌二醇后牛血清中的代謝水平變化，產(chǎn)生了結(jié)合一組選定標(biāo)記強(qiáng)度的篩選模型，此研究首次表明血清代謝組學(xué)在檢測(cè)牛的合成代謝濫用方面具有重要作用;REGAL等[39]利用LC-HRMS為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)方法研究了使用雌二醇/孕酮后的奶牛血清中代謝組的變化，其建立預(yù)測(cè)模型后可用來幫助檢測(cè)牛體內(nèi)是否非法使用這些激素，還找到了雌二醇/孕酮的潛在生物標(biāo)志物，但其具體結(jié)構(gòu)有待闡明。

ANIZAN等[40]研究類固醇類激素在牛體內(nèi)的代謝情況，用全掃描模式研究尿代謝物的尿液曲線，篩選出了2種生物標(biāo)志物5α-雄甾烷-3β，17α-二醇和5α-雄甾烷-2-烯-17-酮，可用于篩查牛體內(nèi)類固醇的濫用情況;REGAL等[44]利用LC-HRMS系統(tǒng)對(duì)用雌二醇-17β處理的奶牛和對(duì)照動(dòng)物的血清樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物在結(jié)構(gòu)上被解釋為二肽，并通過檢測(cè)來測(cè)試其有效性，它已經(jīng)被證實(shí)也在雌二醇處理動(dòng)物的其他樣品中;ANIZAN等[45]研究了雄烯二酮對(duì)牛尿液中二期甾體結(jié)合物代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)在被處理的動(dòng)物樣品中3-硫酸表柔酮濃度的變化有異常。

3?存在問題及局限性

代謝組學(xué)方法針對(duì)的是藥理活性而不是單個(gè)的藥物結(jié)構(gòu)，應(yīng)用組學(xué)方法的原理不是直接檢測(cè)藥物的存在，而是通過靶向或非靶向方法來檢測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的累積生物效應(yīng)，它們產(chǎn)生并篩選數(shù)據(jù)，可用來表明是否可能發(fā)生了藥物濫用情況。從生物學(xué)角度理解，代謝組學(xué)針對(duì)的是一個(gè)完整的生物體系，而不是針對(duì)單獨(dú)一個(gè)細(xì)胞，對(duì)整體隨時(shí)間改變而發(fā)生的代謝全過程進(jìn)行檢測(cè)、鑒別和分類[46]。

但是代謝組學(xué)研究本身是存在缺點(diǎn)的，要求非靶向代謝組學(xué)準(zhǔn)確鑒定代謝物是很難的，且其靈敏度不夠精確，對(duì)低豐度代謝物檢測(cè)率低，其數(shù)據(jù)分析需要依賴公共數(shù)據(jù)庫;同樣，靶向代謝組學(xué)的研究也存在很多局限，其研究需要標(biāo)準(zhǔn)品，需要提前構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，且通量低，所以對(duì)于一些未知物的檢測(cè)是有一定限制的。

代謝組學(xué)技術(shù)分析手段有限，沒有一種分析技術(shù)能夠同時(shí)分析所有的代謝組，只能選擇性的選取多種技術(shù)來進(jìn)行并行分析;代謝組學(xué)所用的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，需要專業(yè)性很強(qiáng)的技術(shù)人員來操作;代謝組學(xué)研究會(huì)得到海量數(shù)據(jù)，處理復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)。在獸藥檢測(cè)的應(yīng)用方面，同樣存在缺陷與不足，代謝組學(xué)對(duì)于獸藥檢測(cè)的數(shù)據(jù)庫到目前為止還不夠完整;另外，生物體本身的代謝受體內(nèi)外各種因素條件的干擾，會(huì)導(dǎo)致樣本的較大差異性，有些條件難以控制會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的低可信度[27，46];而且目前代謝組學(xué)應(yīng)用于獸藥研究的數(shù)據(jù)量還較少，導(dǎo)致研究結(jié)果可能會(huì)存在較大的偏倚。

4?展?望

代謝組學(xué)技術(shù)作為組學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的新興學(xué)科，在食品安全領(lǐng)域，尤其是在動(dòng)物源性食品的獸藥檢測(cè)中具有很好的應(yīng)用前景，為食品質(zhì)量與安全研究提供了新的方法、思路和依據(jù)。

系統(tǒng)代謝產(chǎn)物在各個(gè)生物體系中相類似，因此代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用研究更具有普遍意義。相對(duì)于其他組學(xué)來說，基因和蛋白質(zhì)表達(dá)微小有限的變化可通過相應(yīng)代謝產(chǎn)物表達(dá)而放大，令分析檢測(cè)更為容易。代謝產(chǎn)物分布廣，性質(zhì)差異較大，單靠一種分析手段難以進(jìn)行無偏向性的全面分析。LC-MS技術(shù)、GC-MS技術(shù)以及以它們?yōu)榛A(chǔ)的各種更高水平的技術(shù)平臺(tái)，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLSDA）等各種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析平臺(tái)，皆可為代謝組學(xué)技術(shù)提供不同角度的支持。因此，要根據(jù)所研究樣品的特性及研究目的來選擇方法，并綜合利用技術(shù)平臺(tái)和分析平臺(tái)，以求得到更詳盡的分析結(jié)果。

憑借代謝組學(xué)獨(dú)特的視角研究獸藥的代謝機(jī)制，利于尋找有價(jià)值的特異性標(biāo)志物，可為獸藥監(jiān)測(cè)評(píng)估提供依據(jù)，在未來的應(yīng)用研究中，可利用各種現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)手段以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)的互補(bǔ)聯(lián)用作用，建立大規(guī)模的標(biāo)準(zhǔn)化的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫;隨著高新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)的多層組學(xué)整合分析是未來精準(zhǔn)檢測(cè)分析的發(fā)展趨勢(shì)。通過對(duì)多組學(xué)的聯(lián)合分析，可對(duì)生物體進(jìn)行系統(tǒng)性研究，能夠快速簡(jiǎn)便地獲得更全面、準(zhǔn)確的代謝信息。對(duì)代謝組學(xué)的研究方法進(jìn)行不斷的完善和更新，建立更加精確的系統(tǒng)分析方法，可為確保食品質(zhì)量與安全、預(yù)防和減少食源性疾病發(fā)生概率提供重要技術(shù)支持，特別是對(duì)中國食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估等工作具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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