劉 怡，李 娟

(四川省成都市第二人民醫(yī)院皮膚科 610017)

成纖維細(xì)胞的活化、遷移、增殖，促使了Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成從而導(dǎo)致其在組織中的過度沉積是纖維化疾病的主要致病機(jī)制[1]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，可直接由成纖維細(xì)胞分泌，并作用于成纖維細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并合成膠原，誘導(dǎo)纖維連接蛋白等的產(chǎn)生，提高成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積，增強(qiáng)細(xì)胞收縮的功能，同時(shí)抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性[2-3]。若能有效抑制TGF-β1對(duì)膠原蛋白的促進(jìn)合成作用，則可對(duì)瘢痕等纖維化疾病有一定的治療作用。膠原三螺旋重復(fù)蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1,Cthrc1)是一種表達(dá)在受損動(dòng)脈外膜及內(nèi)膜的分泌型蛋白[4]。Cthrc1基因的表達(dá)和動(dòng)脈損傷的修復(fù)相關(guān)聯(lián)，其表達(dá)和外膜的纖維化保持一致[5]。本研究發(fā)現(xiàn)在成纖維細(xì)胞中Cthrc1呈TGF-β1依賴性升高，Cthrc1特異性地抑制TGF-β1的促膠原蛋白合成作用。通過闡釋Cthrc1與TGF-β1相互之間的關(guān)系對(duì)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響，將對(duì)治療纖維化相關(guān)疾病提供一定的治療思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 人成纖維細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。CCK-8試劑盒購(gòu)自欣博盛生物有限公司。羥脯氨酸(Hyp)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Cthrc1正向引物：5′-CAA GGA AGC CCT GAA ATG A-3′，反向引物:5′-TCC ACT AAT CCA GCA CCA A-3′；β-actin正向引物：5′-AAG GCC AAC CGC GAG AA-3′，反向引物：5′-CCT CGT AGA TGG GCA CA-3′，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。重組人TGF-β1因子購(gòu)自美國(guó)PeProTech公司。Cthrc1-siRNA單基因套裝購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 成纖維細(xì)胞分別接種在RIMP 1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，100 mg/mL的鏈霉素、1×104U/L青霉素)常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定分為空白對(duì)照(NC)組、TGF-β1組、TGF-β1+Cthrc1組、TGF-β1+si-Cthrc1組。

1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染干擾成纖維細(xì)胞Cthrc1的表達(dá) 成纖維細(xì)胞鋪板長(zhǎng)至30%左右密度后，取0.67 μg(50 pmol)的PCMV6-XL4-Cthrc1或siRNA-Cthrc1，用無血清稀釋液適量稀釋，充分混勻，制成RNA稀釋液。取1 μL的Entranster-R4000，加入24 μL無血清稀釋液后制成Entranster-R4000稀釋液，終體積為25 μL，室溫靜置5 min。將Entranster-R4000稀釋液和RNA稀釋液混勻，室溫靜置15 min。至此，轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。將50 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到有0.45 mL全培養(yǎng)基的細(xì)胞上，前后移動(dòng)培養(yǎng)皿，混合均勻。轉(zhuǎn)染后6 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，若轉(zhuǎn)染效果良好則用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞 成纖維細(xì)胞狀態(tài)符合實(shí)驗(yàn)要求后，TGF-β1組加入濃度為103ng/mL TGF-β1因子溶液100～1 900 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)各組Cthrc1 mRNA表達(dá) 各組加入TGF-β1培養(yǎng)24 h后，Triol法提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。根據(jù)Takara RNA PCRTMKIT(AMV)Ver.3.0說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，應(yīng)用SYBR Green qPCR SuperMIX-UDG 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，然后95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s進(jìn)行熔解曲線分析。每份樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每組樣品重復(fù)檢測(cè)5次。應(yīng)用2-△△ct方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5Western blot檢測(cè)各組Cthrc1蛋白表達(dá) 各組加入TGF-β1培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白水平后，以50 μg為上樣量進(jìn)行凝膠電泳。按照目的蛋白分子量選取不同濃度的分離膠分離蛋白并電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，對(duì)應(yīng)一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，相應(yīng)二抗(1∶8 000稀釋)孵育1 h。新配制電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，使用BIO-RAD凝膠成像儀進(jìn)行成像并進(jìn)行分析，用目的蛋白Cthrc1與內(nèi)參蛋白β-actin的光密度比值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力的變化 按照實(shí)驗(yàn)分組建模后，收集各組細(xì)胞，在加入TGF-β1后 24、48、72、96 h依次加入CCK-8原液10 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2.5 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7測(cè)定細(xì)胞上清液中Hyp表達(dá)水平 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別處理各組細(xì)胞后，收集各組TGF-β1刺激24 h后的細(xì)胞上清液，并按照Hyp測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作。計(jì)算公式：Hyp表達(dá)水平(pg/mL)=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空A管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(5 pg/mL)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞Hyp合成 TGF-β1組Cthrc1 mRNA水平高于NC組[(1.48±0.34)vs.(1.01±0.22)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TGF-β1組的細(xì)胞增殖能力于48 h后開始明顯高于NC組，并于96 h達(dá)到峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TGF-β1組Hyp水平明顯高于NC組[(0.31±0.03)vs.(0.20±0.02)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2Cthrc1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞Hyp合成 與TGF-β1組比較，TGF-β1+Cthrc1組細(xì)胞增殖能力在96 h明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TGF-β1+Cthrc1組Hyp水平明顯低于TGF-β1組[(0.13±0.02)vs.(0.32±0.01)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3Cthrc1的缺乏增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞Hyp合成 TGF-β1+si-Cthrc1組的細(xì)胞增殖能力在48、96 h明顯高于TGF-β1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1+si-Cthrc1組的Hyp水平明顯高于TGF-β1組[(0.43±0.03)vs.(0.31±0.01)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：Cthrc1 mRNA表達(dá)情況;B:Cthrc1蛋白表達(dá)情況;C:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;D:Hyp相對(duì)表達(dá)水平；a:P<0.05，與NC組比較

圖1 TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞Hyp合成

A：Cthrc1 mRNA表達(dá)情況;B:Cthrc1蛋白表達(dá)情況;C:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;D:Hyp相對(duì)表達(dá)水平；a:P<0.05，與TGF-β1組比較

圖2 Cthrc1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞Hyp合成

A：Cthrc1 mRNA表達(dá)情況;B:Cthrc1蛋白表達(dá)情況;C:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;D:Hyp相對(duì)表達(dá)水平；a:P<0.05，與TGF-β1組比較

圖3 Cthrc1的缺乏增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞Hyp合成

3 討論

纖維化是各種原因引起的炎癥導(dǎo)致的組織器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞的壞死，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)異常增多，并在組織中過度沉積[6]。目前認(rèn)為成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白增多是許多纖維化疾病的主要特點(diǎn)[7]。在其發(fā)病機(jī)制中促纖維化和抗纖維化因子在調(diào)節(jié)膠原蛋白合成上起著關(guān)鍵的作用[8]。Hyp是一種非必需氨基酸，在膠原蛋白中表達(dá)水平高且恒定，其水平能客觀反映纖維發(fā)生的程度和演變過程[9]。本研究通過調(diào)節(jié)Cthrc1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cthrc1可以影響TGF-β1誘導(dǎo)下成纖維細(xì)胞Hyp的合成，在纖維化疾病中有一定的調(diào)節(jié)作用。

TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)其合成膠原，同時(shí)抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，也是促進(jìn)ECM沉積的主要調(diào)控因子[10]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成Hyp的同時(shí)，也增加了Cthrc1蛋白的表達(dá)。Cthrc1是TGF-β1特異性的抑制劑，可以抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活，在免疫相關(guān)性肝病和特發(fā)性肺纖維化等疾病中有著重要作用[11-12]。本研究通過改變成纖維細(xì)胞Cthrc1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充Cthrc1可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Hyp合成，而干擾Cthrc1則能增強(qiáng)TGF-β1對(duì)Hyp合成的促進(jìn)作用。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化研究中也發(fā)現(xiàn)，Cthrc1可以通過抑制Hyp的合成來保護(hù)肺功能[13]。但并非過度分泌的Cthrc1則有利于纖維化疾病的治療，有研究報(bào)道Cthrc1也可激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[14]。

綜上所述，筆者認(rèn)為TGF-β1與Cthrc1之間存在相互調(diào)節(jié)作用，TGF-β1的表達(dá)可以誘導(dǎo)Cthrc1的表達(dá)，而Cthrc1則反饋性抑制TGF-β1的過度激活，該平衡機(jī)制在纖維化疾病中有著重要調(diào)控作用。在后續(xù)的研究中，筆者將進(jìn)一步探討Cthrc1抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的合理表達(dá)豐度值，若能有效調(diào)節(jié)Cthrc1的表達(dá)，則可為臨床纖維化相關(guān)性疾病的治療提供一些理論依據(jù)。