覃舒婷，莫軍揚,張敏敏，唐 茜,盧林捷，陳 巖，韋業(yè)剛，楊 立

(廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院普外三科 545006)

乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤，其相關(guān)性激素受體，包括雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和Her-2的表達(dá)水平，是選擇個體化內(nèi)分泌治療方案、評估愈后的重要依據(jù)。微小RNA(microRNAs，miRNA/miR) 是一種內(nèi)源性非編碼RNA，具有抑癌基因或類癌基因的功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在乳腺癌的診斷、轉(zhuǎn)移、愈后、耐藥等多方面起了重要作用[1]。本研究通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測乳腺癌組織中miR-206、miR-155的表達(dá)，比較其與ER、PR、無病生存期(disease free survival，DFS)的相關(guān)性，探討其是否能成為一種新的預(yù)測內(nèi)分泌治療敏感度及患者預(yù)后評估的標(biāo)記物，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1-12月本院100例女性乳腺癌患者為研究對象，平均年齡(50.08±10.85)歲；所有患者均按WHO乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進行病理學(xué)分型，TNM分期中Ⅰ期25例，Ⅱ期56例，Ⅲ期19例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌95例，中分化腺癌1例，小葉癌2例，導(dǎo)管內(nèi)癌2例。所有患者在采集組織標(biāo)本前均未經(jīng)放、化療，且無乳腺炎癥等并發(fā)癥。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 收集100例女性乳腺癌組織石蠟標(biāo)本，重新切片用于免疫組織化學(xué)。同時收集術(shù)中乳腺組織，取自病變非壞死部位,置于滅菌凍存管，液氮速凍,-80 ℃保存，用于RT-qPCR。

1.2.2試劑與儀器 Hipure FFPE miRNA Kit提取分離試劑盒購自廣州Magen公司，ReverTra Ace ToYoBo qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海ToYoBo公司，PCR采用KAPA Probe Fast qPCR Master Mix試劑盒購自北京KAPA公司，RT-qPCR儀(型號Mx3005P)購自上海安捷倫公司。兔抗人ER、PR一抗購自美國Cell Signaling公司，羊抗兔二抗、多聚甲醛、石蠟、檸檬酸緩沖液、蘇木素和伊紅等免疫組織化學(xué)試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2.3試驗方法

1.2.3.1免疫組織化學(xué)檢測乳腺癌組織ER、RP表達(dá) 乳腺癌組織標(biāo)本進行切片，每張厚度4 μm?？酒⒍妆矫撓?、梯度乙醇脫水。阻斷內(nèi)源過氧化物酶：3%H2O2，室溫封閉5～10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min，共3次?？乖迯?fù)：0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中煮沸15～20 min，冷卻20 min，PBS沖洗3 min，共3次。血清封閉：滴加5% BSA 封閉液，室溫封閉15 min。加一抗：4 ℃過夜，PBS沖洗3 min，共3次。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。PBS沖洗3 min，共3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥，中性樹脂封片，室溫保存。光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，每張切片取至少5～8個視野，由兩名副高職稱的病理醫(yī)生進行結(jié)果判定。ER、PR染色位于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核，其表達(dá)強度的不同，可呈淺棕色至深棕色。ER、PR陽性標(biāo)準(zhǔn)為：≥1%腫瘤細(xì)胞核陽性。

1.2.3.2miR-206、miR-155水平檢測 取乳腺癌組織，應(yīng)用Trizol試劑、氯仿、異丙醇、RNA提取分離試劑盒，按照isoTMplus及異丙醇按說明書步驟進行操作，提取總RNA。取2.0 μg 總RNA為模板，加入反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。再取cDNA模板，進行PCR擴增，上游引物分別為U6、miR-206、miR-155。U6正向引物：5′-CAC TCA GCT CAC GCA AAT TCG TG-3′；miR-206正向引物：5′-CAC TCA GCT GTG GAA TGT AAG GAA GTG-3′；miR-155正向引物：5′-CAC TCA GCT GTT AAT GCT AAT CGT GAT AG-3′；下游共同引物為miR-27，miR-27反向引物：5′-CTG GTG TCG TGG AGT CG-3′。RT-qPCR條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，讀FAM熒光數(shù)值，40個循環(huán)；30 ℃ 30 s。以參照基因U6和miR-206、miR-155基因作為標(biāo)準(zhǔn)，利用RT-qPCR通過2-△△Cp方法分析相對基因表達(dá)差異，其中△Cp=[Cp(處理組目的基因)-Cp(處理組內(nèi)參基因)]。U6、miR-206、miR-155的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1～3。

圖1 U6的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 miR-155的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4隨訪 采取門診復(fù)查或電話隨訪，隨訪時間截止至2017年12月。失訪10例，90例患者隨訪滿36個月，隨訪率為90%。主要觀察指標(biāo)為DFS。

2 結(jié)果

2.1ER、PR在乳腺癌組織中的表達(dá) 100例乳腺癌患者中，ER表達(dá)陽性77例，陽性率77%。PR表達(dá)陽性66例，陽性率66%，見圖4、5。

A:ER染色陽性；B:ER染色陰性

圖4乳腺癌組織中ER染色結(jié)果(免疫組織化學(xué)法，×200)

A:PR染色陽性；B:R染色陰性

圖5乳腺癌組織中PR染色結(jié)果(免疫組織化學(xué)法，×200)

2.2乳腺癌組織中miR-206和ER、PR表達(dá)的相關(guān)性 乳腺癌組織中miR-206的表達(dá)水平與ER表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而miR-206與PR表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 乳腺癌中miR-206和ER、PR表達(dá)相關(guān)性

2.3乳腺癌組織中miR-155和ER、PR表達(dá)的相關(guān)性 乳腺癌組織中miR-155的表達(dá)和ER、PR表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，見表2。

表2 乳腺癌中miR-155和ER、PR表達(dá)相關(guān)性

圖6 miR-206表達(dá)水平與DFS相關(guān)性

2.4乳腺癌組織中miR-206、miR-155與DFS相關(guān)性 對乳腺癌患者進行36個月的追蹤隨訪，以miR-206相對表達(dá)中位值2-△△Ct=-2.12作為截斷值，Kaplan-Meier分析表明，癌組織中miR-206低表達(dá)者，無病生存率下降；低表達(dá)組平均無病生存時間為33.3(31.9，34.7)個月，高表達(dá)組為35.3(34.6，35.9)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.381，P=0.036)。以miR-155相對表達(dá)中位值2-△△Ct=-0.94作為截斷值，Kaplan-Meier分析表明，癌組織中miR-155高表達(dá)者，DFS率下降；高表達(dá)組平均DFS時間為33.7(32.5，34.9)個月，低表達(dá)組為35.2(34.4，36.0)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.894，P=0.027)，見圖6、7。

圖7 miR-155表達(dá)水平與DFS相關(guān)性

3 討論

目前，無論在國內(nèi)或是國外，乳腺癌都是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，術(shù)后有效的內(nèi)分泌治療和愈后評估對患者尤為重要。乳腺癌是一種激素依賴型腫瘤，雌激素和孕激素已證實與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。臨床上，多依據(jù)癌組織ER、PR、Her-2的表達(dá)情況，來制訂內(nèi)分泌治療方案及評估預(yù)后[2-3]。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，經(jīng)基因芯片分析，部分miRNA具有激素應(yīng)答功能[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過類癌基因或抑癌基因的方式參與了乳腺腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]，因此，miRNA可能與乳腺癌相關(guān)受體有一定的相關(guān)性，本研究通過分析miRNA與ER、PR、DFS的相關(guān)性，因而可認(rèn)為其能成為一種新的預(yù)測內(nèi)分泌治療敏感度及評估預(yù)后的標(biāo)記物。

miR-206是最早發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌相關(guān)的miRNA。miR-206對癌細(xì)胞ER的表達(dá)可能起負(fù)調(diào)控作用。ADAMS等[6]發(fā)現(xiàn)miR-206可與ER mRNA 3′端的結(jié)合位點結(jié)合，導(dǎo)致ER數(shù)量下調(diào)。將miR-206轉(zhuǎn)染入乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中，癌細(xì)胞ER表達(dá)下調(diào)[7]。YIN等[8]培養(yǎng)ER陽性的乳腺癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，miR-206可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)通路抑制上皮-間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果亦顯示miR-206在乳腺癌組織中的表達(dá)與ER的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與PR無相關(guān)性，可能與miR-206的作用機制有關(guān)。多項研究發(fā)現(xiàn)，miR-206主要通過下調(diào)ER及ER共調(diào)節(jié)蛋白mRNA、蛋白表達(dá)[9]，或直接作用于Notch3、Cdc42等蛋白，從而抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，未經(jīng)過PR及相關(guān)作用途徑。miR-155是最早被發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)：miR-155在ER、PR陰性的乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于ER、PR陽性患者，在三陰性或Her-2型乳腺癌組織中高表達(dá)。且血清或癌組織miR-155能早期預(yù)測ER、PR狀態(tài)，以協(xié)助判斷臨床乳腺癌的分子分型[10-11]。本研究結(jié)果顯示，miR-155在乳腺癌組織中的表達(dá)與ER、PR的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-206通過TWF1/MKL1-SRF/IL11信號通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移[12]。而miR-155可促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生負(fù)性預(yù)后效應(yīng)[1]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miR-206和患者DFS呈正相關(guān)，miR-155與DFS呈負(fù)相關(guān)?？梢?，二者對疾病的預(yù)后評估也存在潛在價值。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-206、miR-155的表達(dá)與ER、PR、DFS均有相關(guān)性，其可成為新的預(yù)測內(nèi)分泌治療敏感度及患者預(yù)后評估的標(biāo)記物。下一步可增加樣本量驗證，探索miRNA在乳腺癌早期診斷、腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲、內(nèi)分泌方案選擇及預(yù)后等多方面的價值。