何 熠 熊海風(fēng) 李毅成 方德鵬 余 雪 楊 淵,

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬埌東醫(yī)院，南寧市 530021，電子郵箱：361040956@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，南寧市 530013，3 廣西桂林市人民醫(yī)院高壓氧科，桂林市 541000)

骨關(guān)節(jié)炎是最常見的慢性關(guān)節(jié)病之一，患者不僅長期處于疼痛狀態(tài)，還會(huì)逐漸喪失關(guān)節(jié)功能和活動(dòng)性。骨關(guān)節(jié)炎是最常見的關(guān)節(jié)炎形式，隨著時(shí)間的推移，軟骨磨損加重，病情會(huì)惡化。雖然關(guān)節(jié)軟骨破裂是骨關(guān)節(jié)炎的主要特征，但其他關(guān)節(jié)組織包括滑膜和軟骨下骨，也共同參與了疾病的進(jìn)展。目前尚無可以阻止骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展并逆轉(zhuǎn)損害的藥物[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎的主要治療目標(biāo)是控制疼痛和改善關(guān)節(jié)功能。常用的治療藥物包括非甾體抗炎藥、局部給藥的皮質(zhì)類固醇和黏彈性補(bǔ)充劑。對(duì)于許多患者而言，由于缺乏有效藥物而出現(xiàn)進(jìn)行性軟骨損傷，最終需要手術(shù)干預(yù)。

作為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的一部分，滑膜可以產(chǎn)生滑液，維持關(guān)節(jié)活動(dòng)。在許多關(guān)節(jié)疾病中也同時(shí)存在滑膜病變，其在促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展中起作用[3]。流行病學(xué)研究表明，脛骨和股骨的軟骨損傷進(jìn)展或與炎性滑膜存在一定的聯(lián)系[4-5]，而滑膜組織及其分泌的滑膜液在骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展中起重要作用[4，6]。骨關(guān)節(jié)炎的病因復(fù)雜，由多種因素共同作用，包括遺傳因素、關(guān)節(jié)損傷、肥胖和老化[7]。了解遺傳易感性的生物學(xué)機(jī)制不僅可以為研究疾病的發(fā)病機(jī)制提供新思路，而且還可以開發(fā)出能夠減緩或阻止疾病進(jìn)展的新療法。近年來，高通量基因芯片在疾病的分子診斷、分類、預(yù)后評(píng)估等方面應(yīng)用廣泛，這為研究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制和分子診斷提供了新途徑[8-9]。有學(xué)者使用骨關(guān)節(jié)炎樣品和匹配的對(duì)照樣品開發(fā)了基因表達(dá)文件GSE1919，建立了人骨關(guān)節(jié)炎的分子分類；基于差異基因表達(dá)分析、亞類預(yù)測和通路分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)和不同預(yù)后，可將骨關(guān)節(jié)炎患者分為具有不同遺傳特征的亞組[10]。本研究對(duì)骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織基因芯片數(shù)據(jù)(GSE1919)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在更好地了解骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制，為該疾病的診斷和治療提供有價(jià)值的信息。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù) 于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下載骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織基因芯片數(shù)據(jù)集GSE1919，該數(shù)據(jù)集基于Affymetrix Human Genome U95A Array平臺(tái)，共包括5例骨關(guān)節(jié)炎滑膜樣本(骨關(guān)節(jié)炎組)及5例健康對(duì)照滑膜組織(對(duì)照組)。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異表達(dá)基因的篩選 利用R語言的數(shù)據(jù)差異分析工具包Limma對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，設(shè)置篩選閾值為P<0.05，差異倍數(shù)(fold change,FC)≥2。利用Affy工具包對(duì)基因探針與基因庫中的基因名進(jìn)行匹配，如果多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一基因名，則取其平均表達(dá)值。

1.3 功能富集分析 利用DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析，從分子功能、細(xì)胞成分和生物過程3個(gè)層面對(duì)上調(diào)的DEGs進(jìn)行歸類，以進(jìn)一步了解其相關(guān)功能。同時(shí)，利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)對(duì)上調(diào)的DEGs進(jìn)行信號(hào)通路分析，以了解導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎滑膜病變主要的信號(hào)通路，富集基因數(shù)>2、P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析 基于STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)信息識(shí)別蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)，使用Cytoscape軟件3.4.0(http://www.cytoscape.org/),通過3種[包括等級(jí)(Degree)、最大集團(tuán)中心性(maximal clique centrality，MCC)、最大鄰域組分(maximal neighbourhood component，MNC)]不同的算法構(gòu)建3個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)。使用CytoHubba插件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?。參?shù)設(shè)置為無重量的網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果按降序排列，包括學(xué)位中心性、中介中心性和親密度中心性， 具有前20個(gè)最高中心的節(jié)點(diǎn)被視為中樞基因。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs的篩選結(jié)果 與對(duì)照組相比，在骨關(guān)節(jié)炎組中共有1 145個(gè)DEGs，包括483個(gè)上調(diào)的DEGs和662個(gè)下調(diào)的DEGs，其中上調(diào)的DEGs包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)。 DEGs的火山圖如圖1所示，熱圖如圖2所示。

圖1 GSE1919樣本集中的DEGs的火山圖 圖2 GSE1919樣本集中的DEGs的熱圖

2.2 功能富集分析結(jié)果基因本體富集分析 結(jié)果顯示，在分子功能方面，上調(diào)的DEGs主要涉及受體活性、細(xì)胞黏附分子活性；在細(xì)胞成分方面，上調(diào)的DEGs主要集中于細(xì)胞膜、細(xì)胞外成分、細(xì)胞外間隙等；在生物過程方面，上調(diào)的DEGs主要與細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。見表1。KEGG通路分析結(jié)果顯示，上調(diào)的DEGs顯著富集于磷脂酰肌醇-3-羥激酶-蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體相互作用、TNF信號(hào)通路、黏著斑以及細(xì)胞黏附分子等信號(hào)通路。見表2。

表1 骨關(guān)節(jié)炎患者中上調(diào)的DEGs的基因本體富集分析結(jié)果

表2 骨關(guān)節(jié)炎患者中上調(diào)的DEGs的KEGG通路分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 通過3種不同的算法構(gòu)建了3個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)，得到了相似的結(jié)果。IL-6、IL-8、IGF、AGT在PPI網(wǎng)絡(luò)中顯著上調(diào)。見圖3。

圖3 骨關(guān)節(jié)炎患者中上調(diào)的DEGs的蛋白與蛋白相互作用

3 討 論

近年來，人們對(duì)骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展所涉及的因素及機(jī)制的認(rèn)識(shí)明顯提高。目前，學(xué)界認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎不是單一的疾病，而是多種機(jī)制共同作用的最后階段，其初始階段可以由許多因素觸發(fā)和延續(xù)[11]。根據(jù)此觀點(diǎn)，骨關(guān)節(jié)炎可分為多種亞型，部分亞型可能出現(xiàn)更多的生化及炎癥反應(yīng)，或表現(xiàn)出更多的遺傳特征，但所有這些亞型最終都會(huì)聚合到共同的表型中。然而，骨關(guān)節(jié)炎病理事件的確切順序還不清楚，其中軟骨下骨損傷、滑膜組織慢性炎癥和軟骨侵蝕之間的時(shí)間關(guān)系仍未知[12]。

本研究對(duì)來自骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨樣品和正常樣品進(jìn)行了全面的微陣列芯片分析，最終篩選出483個(gè)上調(diào)的DEGs，其中包括TNF、IL-6、IL-8、IGF、AGT；DEGs主要與細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程有關(guān)；DEGs在TNF信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、絲裂原活化蛋白激酶等信號(hào)通路途徑中顯著富集。

TNF通路被認(rèn)為是參與驅(qū)動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的主要通路。TNF由軟骨細(xì)胞、單核細(xì)胞、成骨細(xì)胞和滑膜組織產(chǎn)生，可誘導(dǎo)產(chǎn)生許多炎癥和分解代謝因子。在骨關(guān)節(jié)炎患者中，TNF水平在滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中明顯升高[13]。TNF可以通過獨(dú)立或協(xié)同作用特異性地結(jié)合兩種特定細(xì)胞膜上的受體，即TNF受體Ⅰ(p55)和TNF受體Ⅱ(orp75)。與正常細(xì)胞相比，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞中p55表達(dá)增加[14]。p55可能是在關(guān)節(jié)組織細(xì)胞中負(fù)責(zé)介導(dǎo)TNF活性的主要受體，但兩種受體類型均被認(rèn)為積極參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并與不同的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)相關(guān)[15]。因此，TNF通路激活可能在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，可作為骨關(guān)節(jié)炎多種生物學(xué)過程的潛在治療靶點(diǎn)。

IL-6及IL-8是骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)軟骨分泌的炎癥因子，是擾亂代謝的關(guān)鍵介質(zhì)，且可增強(qiáng)受累關(guān)節(jié)組織的分解代謝。既往有研究表明，IL-6和IL-8的高表達(dá)是誘導(dǎo)炎癥組織中B細(xì)胞應(yīng)答增加的重要免疫病理因素[16]。Franckhauser等[17]指出，慢性升高的IL-6及IL-8水平可能導(dǎo)致骨骼肌糖代謝紊亂和器官炎癥。在本研究中，IL-6和IL-8是PPI網(wǎng)絡(luò)中顯著上調(diào)的中樞基因。 基于上述研究結(jié)果，我們推測IL-6可能作為主要促炎細(xì)胞因子，參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程。

AGT是一種α-2-球蛋白，主要由肝臟產(chǎn)生并釋放到血液循環(huán)中，并在腎臟分泌的血管緊張素原酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅰ；隨后，其被血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)切割，生成血管緊張素Ⅱ[18]。有證據(jù)表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)的局部成分在肥大的軟骨細(xì)胞中表達(dá)，而在透明軟骨細(xì)胞中則不表達(dá)，提示該系統(tǒng)可能在軟骨細(xì)胞退變中發(fā)揮作用[19]。有證據(jù)表明ACE抑制劑(雷米普利)可以改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血管功能[20]。然而，很少有研究直接顯示ACE抑制劑對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響。在本研究中，AGT基因在骨關(guān)節(jié)炎患者中上調(diào)，且AGT是PPI網(wǎng)絡(luò)中的中樞蛋白，這與既往的研究結(jié)果[8-9]相似。因此，AGT可能在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，但這仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

IGF-1和IGF-2是控制宮內(nèi)和出生后身體生長和發(fā)育的重要生長因子。Ni等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過產(chǎn)前乙醇暴露建立宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠模型，與對(duì)照組相比，產(chǎn)前乙醇暴露組成年后代軟骨破壞增加，骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展加快；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，IGF-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑組分的表達(dá)降低，這與產(chǎn)前乙醇暴露組中胎兒骨骺軟骨中Ⅱ型膠原減少的變化一致。該研究表明，產(chǎn)前乙醇暴露可下調(diào)血液IGF-1和局部軟骨IGF-1信號(hào)水平，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育不良，增加骨關(guān)節(jié)炎易感性。但是，IGF-1和骨關(guān)節(jié)炎之間的確切關(guān)系鮮有研究報(bào)道。 在本研究中，IGF基因是PPI網(wǎng)絡(luò)中最重要的中樞基因,其可能在軟骨Ⅱ型膠原代謝過程中起作用。

DEGs鑒定和深入分析可能有助于確定骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的有用靶點(diǎn)和途徑。IL-6、IL-8、IGF和AGT基因可能是參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的重要基因，這或可為骨關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)的研究提供新的見解。本研究的局限性在于篩選的基因和途徑未經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這可能成為未來研究的焦點(diǎn)。