王秋麗，童小慧，李小東，韓榮春，彭代銀，俞年軍△

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥231200；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥230012）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，在發(fā)展過程中易累及多臟器，比如肝臟脂質(zhì)的堆積、炎細(xì)胞浸潤等[1]。多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua 屬百合科黃精屬植物，與滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricum Red.一同收錄于《中國藥典》（2015 年版一部）。黃精系藥食同源的多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)大宗藥材[2]，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之效[3]?，F(xiàn)代研究表明，黃精主要成分多糖具有降血糖、血脂[4-6]，抗腫瘤[7-9]，抑菌[10]，抗炎[11]，抗病毒[12]，增強(qiáng)免疫[13]等作用。目前，多花黃精多糖的降血糖研究鮮有報道。

STZ 是目前最廣泛的用來誘導(dǎo)I 型糖尿病動物模型的化學(xué)物質(zhì)，通過葡萄糖轉(zhuǎn)運體2（glucose transporter 2，GLUT2）產(chǎn)生毒性作用，破壞胰島β 細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌絕對不足[14]。因此，本實驗擬運用STZ 誘導(dǎo)高血糖，探討多花黃精多糖對糖尿病小鼠血糖及肝臟等影響以及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和儀器

1.1 材料 多花黃精藥材由安徽省青陽縣九華中藥材科技有限公司提供，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定為多花黃精。鏈脲佐菌素（美國Sigma，批號：S0130-500）；血糖試紙（美國強(qiáng)生，批號：4489872）；伊紅染液（索萊寶，批號：G1100）；蘇木素染色液（博士德生物，批號：AR1180-1）；Trizol 試劑盒（Invitorgen，USA，批 號：135404）；FastQuant RT kit（天根，批號：KR151125）。6 周齡SPF 級雌性C57 BL/6 小鼠（18.0±1.0 g），購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（皖）2016-001。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，12 h光照/12 h 黑暗，于早晨7：00 開燈。常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 儀器 穩(wěn)豪血糖儀（UltraEasy）；真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA）；體重秤（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；倒置顯微鏡DMIL LED（德國萊卡）；超微量核酸蛋白測定儀（德國耶那分析儀器股份公司）；熒光定量PCR 儀（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

2 方法

2.1 多糖的制備 取干燥的多花黃精適量，經(jīng)研磨粉碎過篩后，加入10 倍量的95%乙醇溶液回流提取1 h，抽濾收集濾渣，干燥。然后將多花黃精濾渣與8倍量水混合均勻，回流提取2 次，回流提取1 h，抽濾并收集濾液，所得濾液在60 ℃條件下減壓濃縮至一定體積，緩慢滴加無水乙醇同時不斷攬拌，至乙醇的終濃度為80%，放入4 ℃冰箱中過夜。次日進(jìn)行抽濾，濾餅放置于真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，所得粉末即為多花黃精粗多糖[15]。

2.2 分組及給藥 90 只雌性C57BL/6c 小鼠分兩組：正常對照組（n=6）及模型組（n=84）。

模型組小鼠隔夜禁食后，腹腔注射新鮮制備的冷STZ 溶液（溶解于檸檬酸緩沖液中，pH 4.2）。STZ注射劑量為70 mg·kg-1/d，連續(xù)5d，監(jiān)測小鼠血糖變化。于首次注射STZ 1 周后，開始分組給藥。從模型組小鼠中選出72 只血糖水平相近、體重相近的小鼠依次分為：模型組（n=24）、多花黃精多糖低劑量（450 mg·kg-1，n=24）和多花黃精高劑量組（900 mg·kg-1，n=24）。各組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白對照組以及模型組給予等量生理鹽水。

2.3 記錄小鼠死亡率 于首次給藥后，記錄小鼠狀態(tài)以及死亡情況。

2.4 記錄小鼠體重以及測定血糖水平 給藥期間監(jiān)測小鼠體重變化。以首次分組給藥第1 天為D1，于給藥10 d 后采用血糖試紙，尾尖取血測定各組小鼠隨機(jī)血糖水平。

2.5 肝臟組織學(xué)觀察 于給藥10 d 后，頸椎脫臼處死各組小鼠。肝臟組織樣本迅速浸泡在10%的福爾馬林溶液中固定24 h，脫水、石蠟包埋，切成6 μm 厚的薄片，經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。肝臟病變的程度由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行雙盲評分，評分范圍為0～3。

2.6 qPCR 檢測肝臟IL-6、IL-1β、IRS-1 mRNA 水平如2.5 項下處死動物，取肝臟液氮速凍，-80 ℃保存。采用TRIzol 提取總RNA，500ng RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qPCR 檢測肝臟中IL-6、IL-1β、IRS-1 mRNA 水平。反應(yīng)條件為95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，45 次循環(huán)。以GAPDH Ct 值校正，采用2-△△CT法計算IL-6、IL-1β、IRS-1 mRNA相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 qPCR 所需引物序列

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用數(shù)據(jù)分析軟件Graph Pad Prism 6 采用t 檢驗，生存率曲線顯著性采用Log-rank（Mantel-Cox）檢測。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 STZ 誘導(dǎo)T1DM 模型 采用STZ 誘導(dǎo)T1DM 模型。每只小鼠連續(xù)5 d 腹腔注射STZ（70 mg·kg-1），并檢測小鼠血糖變化。于首次給予STZ 后檢測血糖，其值變化明顯。如圖1 所示，與正常對照組相比，模型組小鼠的血糖于首次STZ 注射第5 天后開始顯著升高（20.08±3.397 vs.7.25±0.728 mmol·L-1）。并且持續(xù)升高至首次STZ 注射第7 天。觀察小鼠發(fā)現(xiàn)，正常對照組小鼠飲食、飲水正常，體毛光澤，體重增加明顯。而STZ 注射小鼠出現(xiàn)消瘦、體表皮毛無光澤以及活動減少等現(xiàn)象，同時飼養(yǎng)籠墊料臟濕加速。以上變化符合糖尿病病癥中的“三多一少”（多飲、多食、多尿及體重減少）的特征[16]。

圖1 連續(xù)給予5 次STZ（70 mg·kg-1）對小鼠隨機(jī)血糖的影響

因此，本實驗采用連續(xù)5d 腹腔注射STZ（70 mg·kg-1）并于1 周后進(jìn)行多花黃精多糖干預(yù)的實驗方案。

3.2 多花黃精多糖提高T1DM 模型小鼠的存活率實驗中發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠在實驗期間內(nèi)的存活率為100%.與正常對照組相比，模型組小鼠死亡率明顯增加，多數(shù)動物出現(xiàn)后肢紅腫、斷足等癥狀。于正式實驗的10 d 內(nèi)存活率僅為16.67%（4/24）。而與模型組相比，多花黃精多糖高劑量組（900 mg·kg-1）小鼠的死亡率處于較低水平，于實驗10d 后存活率為66.67%（16/24）。并且，動物未出現(xiàn)后肢紅腫、斷足等異常情況。多花黃精多糖低劑量組（450 mg·kg-1）小鼠的存活率與模型組相比無顯著性差異25%（6/24）。結(jié)果如圖2 所示。

圖2 多花黃精多糖對T1MD 小鼠存活率的影響

因此，該結(jié)果提示多花黃精多糖高劑量顯著降低T1DM 模型小鼠的急性死亡率。

3.3 多花黃精多糖對T1DM 模型小鼠體重的影響本實驗同時測定多花黃精多糖對小鼠體重的影響，結(jié)果如圖3 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠體重下降約40%（19.6±0.945 vs.31.9±1.862 g）。多花黃精多糖低劑量組（450 mg·kg-1）小鼠的體重相比模型組小鼠顯著增加（23.3±1.358 vs.18.9±0.945 g）。并且，與低劑量組相比，多花黃精高劑量組（900 mg·kg-1）有增加小鼠體重的趨勢，但數(shù)據(jù)檢測無顯著性差異（24.7±0.928 vs.23.3±1.358 g）。

以上實驗結(jié)果提示，盡管不能完全逆轉(zhuǎn)T1DM 小鼠體重的下降，多花黃精多糖低劑量及高劑量均有顯著增加糖尿病小鼠體重的作用。

圖3 多花黃精多糖對T1MD 小鼠體重的影響

3.4 多花黃精多糖對T1DM 模型小鼠隨機(jī)血糖的影響 根據(jù)實驗觀測到的多花黃精多糖顯著增加高血糖小鼠的存活率以及逆轉(zhuǎn)其體重下降，本研究同時對各組小鼠隨機(jī)血糖進(jìn)行檢測，探究多花黃精多糖以上的作用是否與影響小鼠血糖水平相關(guān)。于實驗結(jié)束處死小鼠前測定血糖水平，結(jié)果如圖4 所示。與正常對照組相比，模型組小鼠血糖顯著升高（8.08±0.3597 vs.30.7±1.664 mmol·L-1）。多花黃精高劑量組（900 mg·kg-1）小鼠與模型組小鼠相比，血糖水平下降有顯著性差異。而低劑量多花黃精多糖對模型小鼠的血糖水平影響較弱。

以上實驗結(jié)果提示，多花黃精多糖高劑量（900 mg·kg-1）具有一定程度的降低T1DM 小鼠隨機(jī)血糖水平的作用。

圖4 多花黃精多糖對T1MD 小鼠隨機(jī)血糖的影響

3.5 多花黃精多糖改善T1DM 模型小鼠肝損傷 實驗采用HE 染色法檢測多花黃精多糖是否通過影響小鼠肝臟狀態(tài)從而改善T1DM 小鼠的生存率。結(jié)果如圖5 所示，正常對照組小鼠肝細(xì)胞以索狀順序排列，環(huán)繞中央靜脈成放射狀。細(xì)胞核位于細(xì)胞質(zhì)中央（如圖5A 中寬箭頭所示），肝細(xì)胞之間由肝竇連接，肝竇清晰（如圖-5A 中細(xì)箭頭所示）。與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟實質(zhì)局部出現(xiàn)大量單核樣炎癥細(xì)胞的浸潤（如圖5B 中方框所示），肝細(xì)胞變性明顯：大量的肝細(xì)胞出現(xiàn)濃的嗜酸性細(xì)胞質(zhì)和固縮的細(xì)胞核（如圖5B 中寬箭頭所示），并且肝細(xì)胞排列雜亂、肝竇分辨不清，提示肝臟出現(xiàn)硬化。低劑量多花黃精多糖組小鼠肝臟的仍然存在一定程度的病變：炎癥細(xì)胞浸潤明顯、一部分的肝細(xì)胞變性以及肝臟細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂（如圖5C 所示）。而高劑量多花黃精多糖顯著改善模型小鼠肝臟的病變：炎癥細(xì)胞浸潤相對減少、肝細(xì)胞變性明顯得到改善以及肝細(xì)胞排列整齊等（如圖5D 所示）。

圖5 多花黃精多糖對T1MD 小鼠肝臟病理形態(tài)改變的影響（HE，×200）

表2 多花黃精多糖對模型小鼠肝臟病理形態(tài)影響的雙盲評分

各組小鼠HE 染色切片隨機(jī)選取10 個不同部位拍攝，并對各組小鼠肝臟病變進(jìn)行雙盲定性評分。評分結(jié)果如表2 所示，結(jié)果提示黃精多糖高劑量可以顯著改善模型小鼠肝臟炎癥細(xì)胞清潤以及肝細(xì)胞變性等病理改變。

3.6 多花黃精多糖對T1DM 模型小鼠肝臟IL-6、IL-1β、IRS-1 mRNA 水平 實驗繼續(xù)采用qPCR 對小鼠肝臟炎癥因子IL-6 和IL-1β 的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖6A、6B：與正常組相比，模型小鼠肝臟IL-6、IL-1β 表達(dá)水平顯著升高，與肝臟組織病變結(jié)果（圖5）相吻合。多花黃精高、低劑量均能顯著降低TD1M 小鼠肝臟IL-6、IL-1β 的過表達(dá)。由于炎癥是導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的重要原因，我們檢測了胰島素通路中胰島素底物1（IRS-1）的表達(dá)水平。結(jié)果如圖6C：高血糖顯著降低小鼠肝臟中IRS-1 mRNA 水平，提示胰島素通路受損。而多花黃精劑量依賴性的升高TIDM 小鼠肝臟中的下降的IRS-1 的基因表達(dá)。

以上數(shù)據(jù)表明，多花黃精多糖能夠改善糖尿病肝臟的炎癥和胰島素敏感性。

4 討論

目前全世界有超過3 億人罹患糖尿病，具有流行病學(xué)趨勢[17]。糖尿病主要包括Ⅰ型糖尿病以及Ⅱ型糖尿病。T1DM 是一種自身免疫性疾病，由于胰腺胰島β 細(xì)胞遭受機(jī)體異常免疫的攻擊，導(dǎo)致胰島素分泌障礙及血糖水平上升[18]。

圖6 多花黃精多糖對各組小鼠肝臟IL-6、IL-1β、IRS-1基因水平的影響

由于胰島素對葡萄糖、脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的合成效應(yīng)，胰島素的缺乏將引起機(jī)體一系列的代謝異常，比如肝臟中失控的糖原分解、糖異生、酮體生成以及脂肪組織中甘油三酯的分解。這些變化將導(dǎo)致機(jī)體處于持續(xù)的能量分解狀態(tài)，最終引起體重下降[19]，并最終引起死亡率升高。本實驗結(jié)果中多花黃精高劑量（900 mg·kg-1）顯著降低T1DM 模型小鼠的急性死亡率，提示多花黃精多糖具有積極干預(yù)T1DM 發(fā)展的作用。

STZ 誘導(dǎo)模型能夠通過減少胰島素釋放，導(dǎo)致動物體重下降。例如，Viviane El-Helou 等報道，9～11 周齡的雄性SD 大鼠單次腹腔注射STZ（60 mg·kg-1），3周后大鼠的體重下降約34%，同時血糖上升至28 mmol·L-1左右[20]。此外，Sisse A N?rgaard 等報道：6-8周齡的雄性129S2/SvPastCrl 鼠，兩次腹腔注射STZ（100 mg·kg-1/次，間隔3 d），3 周后體重小鼠體重下降約10%[21]。

而相比雄性小鼠，15 周齡雌性C57BL/6 小鼠經(jīng)STZ 誘導(dǎo)高血糖后，體重下降更加明顯[22]。另外，臨床數(shù)據(jù)提示糖尿病女性患者較男性患者，某些并發(fā)癥的發(fā)病率顯著偏高[23]。Harmesh N.Chaudhari 等報道，雌性SD 大鼠較雌性大鼠更容易受高血糖影響。11 周齡SD 大鼠腹腔注射STZ（50 mg·kg-1），兩周后雌性大鼠胰島素水平顯著低于雄性大鼠。另外，雌性小鼠肝臟中抗氧化蛋白DJ1 顯著降低[24]。

推測雌性動物更容易受到胰島素缺乏的影響。本實驗中在首次注射STZ（70 mg·kg-1）第10 天，小鼠的體重下降約40%與文獻(xiàn)報道基本相符合。而450～900 mg·kg-1的多花黃精多糖能夠顯著降低T1DM 模型小鼠的體重下降，900 mg·kg-1的多花黃精多糖顯著抑制T1DM 模型小鼠的隨機(jī)血糖水平。提示多花黃精多糖可能具有保護(hù)胰島β 細(xì)胞免受STZ 誘導(dǎo)的凋亡，或者能夠通過改善T1DM 小鼠代謝紊亂的作用。因此，本實驗采用HE 染色法探究多花黃精多糖對機(jī)體中代謝重要器官肝臟的影響。

高血糖會導(dǎo)致臟器損傷，比如肝臟[25]。非酒精性脂肪肝包括硬化和非酒精性硬化性肝炎是糖尿病肝臟主要的病變，并且是肝臟損傷的主要原因[26]。據(jù)報道：STZ 誘導(dǎo)的T1DM 大鼠，肝臟超微結(jié)構(gòu)顯著改變。出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)縮合，線粒體腫大，粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹等病變[27]。本實驗HE 染色結(jié)果STZ 誘導(dǎo)的高血糖導(dǎo)致小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病變?nèi)绺渭?xì)胞變性、壞死，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等，與文獻(xiàn)報道相符。并且，肝臟實質(zhì)中出現(xiàn)大量的炎細(xì)胞浸潤。

肝臟在機(jī)體固有免疫反應(yīng)中具有重要作用，肝臟細(xì)胞中包含多種免疫細(xì)胞，包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞等[28-29]。高血糖能夠通過促進(jìn)骨髓中髓系祖細(xì)胞的增殖和分化從而升高循環(huán)系統(tǒng)中單核細(xì)胞以及嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量[30]。Yong-Sun Lee 等研究證明：STZ 誘導(dǎo)的高血糖通過促進(jìn)肝臟Treg 細(xì)胞遷移，顯著增加小鼠肝臟中單核細(xì)胞核嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量。并且促進(jìn)單核細(xì)胞前炎癥因子如：TNF-α，IL-1β，TFN-γ 及IL-6 等的表達(dá)[31]。因此，本實驗采用qPCR 檢測多花黃精多糖對其肝臟炎癥因子IL-1β 和IL-6 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示，450～900 mg·kg-1的多花黃精多糖能夠顯著降低其 基因的表達(dá)。此外，多花黃精多糖能夠顯著上調(diào)糖尿病肝臟中IRS-1 的基因水平。

綜上所述，本研究表明，多花黃精多糖顯著改善STZ 誘導(dǎo)的雌性T1DM 小鼠的存活率。可能與其有效抑制T1DM 過程中小鼠體重下降，并且抑制肝臟炎癥細(xì)胞浸潤、抑制炎癥因子的表達(dá)及提高胰島素受體底物的表達(dá)，從而改善肝臟免疫反應(yīng)的作用相關(guān)。為進(jìn)一步研究多花黃精多糖治療血糖代謝紊亂等疾病提供初步的實驗依據(jù)。