曲崇正，劉 姣，陶 靜，江鋼輝

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州510360；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405）

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性退行性疾病，主要病變特征為關(guān)節(jié)軟骨損壞、關(guān)節(jié)囊退變及滑膜炎癥反應(yīng)，早期主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛，發(fā)展至中晚期可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、活動障礙等[1-5]。目前的臨床研究證明，推拿可以有效防治膝骨性關(guān)節(jié)炎[6-7]，但其機制不夠明確。近來研究發(fā)現(xiàn)，膝骨性關(guān)節(jié)炎的病變除了與軟骨的退變相關(guān)外，滑膜也占據(jù)主導(dǎo)地位[8-9]。TLR4/NF－κBp65 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來膝骨性關(guān)節(jié)炎方面研究較多的炎癥通路，而NF-ΚBp65、TRAF6 是這條通路中的2 個關(guān)鍵致炎因子[10]。本實驗通過觀察膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 及蛋白的表達，探討推拿治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的機制。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計 隨機對照動物體內(nèi)實驗

1.2 時間及地點 實驗于2018 年3 月22 日至2018年5 月19 日在廣州中藥大學(xué)動物實驗中心完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗動物 3 月齡健康SPF 級SD 雌性大鼠50 只，體質(zhì)量180～220 g，由山東省實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20140007。所有實驗大鼠均在SPF 級實驗室中飼養(yǎng)，不限飲食，自由進食飼料和水。

單位在用該方法來展開分析時，其需要把成本看成是產(chǎn)量的函數(shù)，然后再從此角度來展開研究，當(dāng)?shù)贸鼋Y(jié)論之后，其需要與原始的成本與當(dāng)前的結(jié)果進行成本區(qū)分，即主要分為兩大類型。需要注意的是，聯(lián)系成本與產(chǎn)品自身的動態(tài)分析，其是構(gòu)成管理會計的重要部分。

1.3.2 實驗用主要試劑 熒光定量PCR 檢測試劑盒（AOPR-1200，Genecopies）；TRIzol Reagent（DP424，天根）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DBI-2220，DBI）；DEPC（V900882，Vetec）；木瓜蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司S10011，CAS：9001-73-4）；塞來昔布（輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140072）；Anti-NF-kB p65 antibody（Abcam，8242T）；RP-Goat Anti-Mouse IgG（Jackson，115-035-003）。

4 周推拿、灌胃給藥治療結(jié)束后處死所有大鼠，取出膝關(guān)節(jié)滑膜用于熒光定量PCR、Western blot 檢測。

2.3 各組滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 的表達水平

1.4 方法

1.4.1 分組與造模 采用隨機化的原則，抽取10 只大鼠為空白組，余下40 只大鼠采用木瓜蛋白酶法[11-12]制作大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，待造模成功后，再將造模大鼠隨機分為模型組、推拿組、灌胃組、推拿加灌胃組，每組10 只。

1.5 主要觀察指標(biāo) 實時熒光定量PCR 檢測各組大鼠滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表達水平；Western blot 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達水平。

2.2 滑膜形態(tài)觀察 經(jīng)肉眼觀察，空白組大鼠滑膜平滑光亮，呈粉紅色，薄而柔潤。模型組大鼠滑膜顏色較深，組織水腫、變厚。推拿組、推拿加灌胃組大鼠滑膜組織顏色較正常稍變深，灌胃大鼠滑膜顏色呈紅色。

在中國其實也活躍著一批對沃爾沃愛到無以復(fù)加的車主和車迷，他們除了會關(guān)注任何一輛沃爾沃的新車，更將擁有“方盒子”車身造型的經(jīng)典沃爾沃車型收藏至今。對于我們雜志的很多讀者們來說，老沃爾沃車主俱樂部的這些會員們并不陌生。早在沃爾沃V90 Cross Country在中國上市時，我們就曾采訪過這個組織的幾位骨干成員。盡管國內(nèi)國I、國II排放車型限制已實施許久，但如今的他們依舊不離不棄駕駛著自己的老車，和所有志同道合的沃爾沃粉絲們分享著有關(guān)斯堪的納維亞的快樂。

1.3.3 實驗設(shè)備 熒光定量PCR 儀（7500，ABI）；基因擴增儀（9600，珠海黑馬）；多功能酶標(biāo)儀（上?，F(xiàn)科儀器有限公司）；掃描儀（Canon）；暗匣（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；感光膠片（kodak）；電泳儀（北京六一儀器廠）；臺式高速離心機（D3204R，SCIlogex）；微量核酸定量儀（SMA4000，Merinton）；灰度分析軟件（Image J）。

1.4.3 熒光定量PCR 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表達 運用Trizol 法對大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜進行總RNA 提取，然后進行逆轉(zhuǎn)錄操作，嚴格按照試劑盒說明書進行，熒光定量PCR 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA 表達水平。本實驗采用GAPDH 作為內(nèi)參，引物序列見表1。

圖6設(shè)振元個數(shù)為n個，從左到右依次排列，tn為陣元n延時時間，θ為聲束偏轉(zhuǎn)角，d為陣元中心距，c為超聲聲速，可得相控陣超聲聲束偏轉(zhuǎn)的延時法則為:

表1 引物序列

職業(yè)教育是以培養(yǎng)高素質(zhì)的技能型人才為目標(biāo)的，因此在教學(xué)過程中要著力培養(yǎng)學(xué)生的動手能力、綜合職業(yè)素質(zhì)和創(chuàng)新能力。職業(yè)教育的教學(xué)方法同傳統(tǒng)的教學(xué)方法相比也有很大的不同。職業(yè)教育面對的對象大都是初中、高中畢業(yè)生，自控能力不強、基礎(chǔ)差，在學(xué)習(xí)中不會很主動、很積極地學(xué)習(xí)各種專業(yè)知識，導(dǎo)致教與學(xué)的效果都不是很好。鐵道工程機械系統(tǒng)故障排除課程實踐性強，能引起學(xué)生的興趣，培養(yǎng)學(xué)生的實踐精神與創(chuàng)新能力。教學(xué)方法直接影響教學(xué)效果，而“任務(wù)驅(qū)動情景教學(xué)法”可以達到比較理想的教學(xué)效果。

造模方法：使用10%水合氯醛生理鹽水溶液腹腔麻醉大鼠后，將大鼠雙膝關(guān)節(jié)絨毛剃凈，消毒皮膚表面，屈曲大鼠膝骨關(guān)節(jié)以便于觸到外膝眼所在，確定進針點后，沿髁間窩方向進針，針頭刺入皮膚表面后會有落空感，然后將木瓜蛋白酶推入，雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔分別注射4%木瓜蛋白酶0.2 mL。出針后按壓針口約1 分鐘，用酒精擦凈血跡，最后將大鼠放回籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。于實驗開始的第1、4、7 天重復(fù)操作。關(guān)節(jié)注射3 次后，使用動物實驗跑臺驅(qū)趕大鼠跑步1 周，每天20 min。

1.4.4 Western blot 檢測TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達將凍存與-80℃冰箱的滑膜組織取出備用，使用RIPA 裂解液將細胞裂解，按說明書步驟配制總蛋白溶液，再將滑膜組織勻漿。BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。測完蛋白含量后，按照5 ∶1 的比例加入蛋白上樣緩沖液，滾水煮約5 min。將樣本配制于分離膠及濃縮膠中進行電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫下將膜脫色后，使用5%的脫脂牛奶封閉一小時，加入配制的稀釋一抗（TBST 溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST 溶解的5%BSA），4℃過夜。洗膜后，再次加入稀釋一抗室溫下孵育30 min 后洗膜。用化學(xué)發(fā)光劑顯影，獲取圖像，Image J 軟件處理系統(tǒng)分析TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達水平。以GAPDH 作內(nèi)參對照，每個蛋白重復(fù)檢測3 次。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物數(shù)量分析 實驗過程中無大鼠死亡，除為驗證造模是否成功每組處死1 只大鼠外，余下大鼠每組9 只均完成所有干預(yù)治療，進入結(jié)果分析。

1.4.2 干預(yù)方法 造模完成后的第1 天，進行推拿、灌胃給藥治療。推拿組將大鼠固定于大鼠固定器上，遵循《實驗針灸學(xué)》[13]的取穴原則確定穴位所在，待大鼠平靜后，于大鼠膝關(guān)節(jié)的內(nèi)膝眼、外膝眼、血海、梁丘等穴行一指禪推法，以拇指前端精準(zhǔn)接觸穴位，頻率控制約120 次/min，每穴推約2 min，最后屈伸膝關(guān)節(jié)10 次，結(jié)束治療，每次總治療時間約10 min，每天1 次。參照《藥理實驗方法學(xué)》[14]種屬間等效劑量折算表，灌胃組予以塞來昔布24 mg/kg·d 灌胃，藥物劑量：每天塞來昔布24 mg/kg 溶于生理鹽水中配制成混懸液，定時給藥，每天1 次。推拿加灌胃組予以上2種干預(yù)方式，每天1 次。

1.3.4 溶液配制 磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA 試劑配制100 mM PMSF 10 μL，加蛋白酶抑制劑5 μL，加磷酸化蛋白酶抑制劑5 μL，混勻；30%丙烯酰胺（1 L）：BIS 10 g 配丙烯酰胺290 g，加入去離子水直至1 000 mL；TBS 緩沖液（1 L）：10 mL Na-Cl 8.8 g 配1 M Tris-HCl（pH=7.5），加入去離子水直到1 000 mL；轉(zhuǎn)移緩沖液（2L）：甲醇400 mL 配甘氨酸28.8 g 配Tris 4.84 g 加入去離子水直到2 000 mL；非磷酸化蛋白酶抑制劑：每1 mL RIPA 試劑配制100 mM PMSF 10 μL、蛋白酶抑制劑5 μL，混勻；電泳緩沖液（2L）：2 g SDS 配37.54 g 甘氨酸配6.06 g Tris 加入去離子水直到2 000 mL。

2.3.1 TRAF6 mRNA 表達水平 與空白組相比，模型組、推拿組、灌胃組的TRAF6 mRNA 表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），推拿加灌胃組與空白組相比TRAF6 mRNA 表達幾乎無差異，稍上調(diào)（P>0.05）；與模型組相比，各治療組TRAF6 mRNA 表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且各治療組TRAF6 mRNA 表達量：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

貴州9個地區(qū)土壤對Cd的吸附△Go<0，說明吸附反應(yīng)可自發(fā)進行。在相同pH條件下，土壤對重金屬的吸附量與初始濃度呈正相關(guān)；在不同pH條件下，土壤對重金屬Cd的吸附量隨pH升高而逐漸增大。

2.3.2 NF-ΚBp65 mRNA 表達水平 與空白組相比，模型組、推拿組、灌胃組的NF-ΚBp65 mRNA 表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），推拿加灌胃組與空白組相比NF-ΚBp65 mRNA 表達幾乎無差異，稍上調(diào)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與模型組相比，各治療組NF-ΚBp65 mRNA 表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各治療組NF-ΚBp65 mRNA 表達量：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖1 各組大鼠滑膜組織TRAF6 mRNA 表達水平

圖2 各組大鼠滑膜組織NF-ΚBp65 mRNA 表達水平

表2 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA的表達水平（s，n=9）

表2 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 mRNA的表達水平（s，n=9）

注：與空白組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05

2.4 各組滑膜TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平與空白組相比，其余各組TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，其余各組TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各治療組TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白表達：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

小說《斗破蒼穹》，主人公蕭炎，從一開始的“廢柴”，到最后肩負起家族復(fù)興的重擔(dān)，并逐步走向大陸巔峰，成為天才的故事告訴我們一個令我們受益終生的道理，那就是：只有靠自己的努力奮斗的人，才有可能實現(xiàn)自己的理想！小說本身所體現(xiàn)的精神與內(nèi)涵，是一個屬于不斷奮斗的歷史，是一段不斷前行的歷史。主人公有著絕強的性格，永不言敗的精神，一路闖蕩，一次又一次地創(chuàng)造不可思議的奇跡。

表3 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平（s，n=9，μmol/L）

表3 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平（s，n=9，μmol/L）

注：與空白組比，*P＜0.05；與模型組比，#P＜0.05

圖3 各組大鼠滑膜組織TRAF6、NF-ΚBp65 蛋白的表達水平（Western blotting）

3 討論

隨著對TLR4 研究的廣泛深入，OA 患者組織中的TLR4 受到的關(guān)注逐漸增多。TLR4 是TLRs 家族中的一員，作為一類I 型跨膜蛋白受體[15]，它的激活可誘導(dǎo)很強的免疫反應(yīng)，在天然免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮主要作用[16-17]。當(dāng)TLR4 被激活后，TLR4 可以通過其下游的MyD88 依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來激活各種炎癥因子。MyD88 是TLR4 信號通路中的關(guān)鍵接頭分子之一，主要作用是傳遞上游信息，在疾病的發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生重要作用[18]。當(dāng)激活TLR4-MD2-CD14 復(fù)合體之后，TLR4 與MyD88 Toll 結(jié)構(gòu)相結(jié)合，接著產(chǎn)生一連串級聯(lián)反應(yīng)，再通過結(jié)合TRAF6 來激活I(lǐng)κB 激酶（IKK）復(fù)合體[19-20]。談冰[10]等研究發(fā)現(xiàn)新風(fēng)膠囊通過下調(diào)NF-ΚBp65、TRAF6 的表達水平，降低異常的炎癥免疫反應(yīng)，進而減輕膝骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛及僵硬癥狀。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）屬于TRAFs 家族，相對分子量為60 kD，由530 個氨基酸組成[21]。TRAF6 直接或間接參與許多條滑膜組織炎癥信號通路的活化過程，調(diào)控炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，與破骨細胞的分化、存活及骨的重吸收等密切相關(guān)[22-23]。在炎癥反應(yīng)、骨代謝、細胞凋亡及應(yīng)激反應(yīng)等方面具有重要意義[24-25]。由表2 和表3 的可以看出：與空白組相比，其余各組TRAF6 mRNA 和蛋白表達均上調(diào)，說明和正常大鼠對比，膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中的TRAF6 mRNA 和蛋白含量均是高表達的，該因子與膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)；與模型組相比，其余各組TRAF6 mRNA 和蛋白表達均下調(diào)，說明各治療組都能有效抑制了大鼠滑膜組織的TRAF6 表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。從圖1和圖3 可以看出：各治療組在與模型組相比TRAF6 mRNA 和蛋白表達均下調(diào)的同時，組間比較二者的表達也存在差異，且表達量都表現(xiàn)為：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組。這說明各治療組在有效抑制了大鼠滑膜組織的TRAF6 mRNA 和蛋白表達方面，推拿組優(yōu)于灌胃組，但推拿加灌胃組的效果更好。

口腔專業(yè)研究生規(guī)范化培訓(xùn)模式為理論課集中培訓(xùn)、臨床見習(xí)和臨床實習(xí)。目前，國家規(guī)定的規(guī)范化培訓(xùn)時間是3年，但有效的培訓(xùn)時間并不充足。其原因主要為：整個培訓(xùn)計劃、培訓(xùn)內(nèi)容和實施流程存在不足；碎片時間利用較差，因材施教的空間較少。以上因素導(dǎo)致了口腔專業(yè)研究生在規(guī)范化培訓(xùn)中操作技能的有效培訓(xùn)時間明顯減少，進而降低了規(guī)范化培訓(xùn)的效率。

NF-κB 家族歸屬于Rel 蛋白家族，該家族共有5個成員，NF-κB1，NF-κB2、Rel A（p65）、Rel B 和c-Rel[26]，NF-κBp65 在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生中起到重要的作用[27-29]。由表2 和表3 可以看出：與空白組相比，其余各組NF-κBp65 mRNA 和蛋白表達上調(diào)，說明較正常大鼠來說，膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中的NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白含量均升高，該因子與膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)；與模型相比，其余各組NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白表達均下調(diào)，說明各治療組都能有效抑制了大鼠滑膜組織的NFΚBp65 表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。從圖2 和圖3 可以看出：各治療組在與模型組相比NF-κBp65 mRNA 和蛋白表達均下降的同時，組間比較二者的表達也存在差異，且表達量都表現(xiàn)為：推拿加灌胃組＜推拿組＜灌胃組，從而說明各治療組在有效抑制了大鼠滑膜組織的NF-κBp65 mRNA 和蛋白表達方面，推拿組優(yōu)于灌胃組，但推拿加灌胃組效果更好。

推拿療法是醫(yī)者運用特定的手法作用于患者體表；可以通過刺激穴位或痛點，達到活血止痛、疏經(jīng)通絡(luò)的作用[30]。一指禪推法為一指禪流派的經(jīng)典治療手法，具有操作簡單，著力面積小，力量集中的特點，被廣泛用于科研及臨床[31]。胡炳麟[32]等研究發(fā)現(xiàn)一指禪推法能有效減輕膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)疼痛。本次實驗使用一指禪推法作用于大鼠血海、梁丘、內(nèi)膝眼、外膝眼4 穴，再配合膝關(guān)節(jié)屈伸法，以達到舒筋骨、利關(guān)節(jié)的目的。

隨著高等教育的改革，地方師范院校培養(yǎng)中小學(xué)教師的使命被賦予了一種全新意義的綜合性人才培養(yǎng)基地的標(biāo)識，向著更為全面的綜合性院校發(fā)展。教師資格證的統(tǒng)考和非師范院校的不斷增加，加之大學(xué)生就業(yè)的嚴峻性和就業(yè)渠道的多樣性，許多非師范生的學(xué)生選擇了教師職業(yè)，而師范院校的學(xué)生卻另辟蹊經(jīng)，開創(chuàng)自己的求職創(chuàng)業(yè)之路。面對這種現(xiàn)狀，地方師范院校的人才培養(yǎng)模式及教師的課堂教學(xué)方法、手段都要不斷改革，既要凸顯“師范性”，又要兼顧學(xué)生職業(yè)變化的需求，要使學(xué)生具備終身發(fā)展的能力及素養(yǎng)。

綜上所述，推拿通過下調(diào)膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織TRAF-6、NF-ΚBp65 mRNA 和蛋白的表達，減輕滑膜炎癥反應(yīng)，從而起到消炎止痛的作用，最終達到防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的目的，這為推拿防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制的臨床研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。