苗 咪，馮文哲，陰新元，柴小琴，朱建東

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽712000；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽712000）

肛瘺，中醫(yī)稱之為“肛漏”，是指肛管、直腸與肛門周圍皮膚之間所形成的異常通道，目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制說法較多，但大眾較為認(rèn)可的學(xué)說是由于肛竇感染引起，其為肛癰未及時(shí)處理或處理不當(dāng)所致[1]。肛瘺自愈較為困難，為臨床極其常見、多發(fā)的肛腸疾病，尤其以男性居多[2]。古代醫(yī)家認(rèn)為漏病的病因有三：一是由痔形成，二是漏病多由癰潰后形成，三是久咳引起[3]。明代《永類鈴方》首創(chuàng)掛線療法治療肛瘺，說明自古以來手術(shù)就是肛瘺的主要治療方法。肛瘺發(fā)病多因濕熱邪毒而引起，濕與熱滯留于術(shù)后創(chuàng)面，阻礙氣血運(yùn)行，而導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合，此乃肛瘺創(chuàng)面不易愈合的病因病機(jī)[2]。因而尋求一種能夠有效的促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面愈合的方法顯得尤為重要。肛瘺術(shù)后外治法主要是基于化腐生肌理論的治療。如果傷口分泌物較少，肉芽生長緩慢，則主要以“煨膿長肉”法為主。煨膿長肉法是中醫(yī)外科的特色療法，目前在臨床上常用來治療一些慢性難愈性創(chuàng)面[4]。本課題將“煨膿長肉”理論作用下擬定的五谷麒麟膏應(yīng)用于促進(jìn)SD 大鼠肛瘺創(chuàng)面模型愈合的實(shí)驗(yàn)研究，擴(kuò)大了“煨膿長肉”法的運(yùn)用范圍，我們以細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)，通過Bcl-xl、Bak蛋白表達(dá)水平，從分子水平論述五谷麒麟膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 120 只雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量20～150 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（陜）2017-003。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)溫度：20～25 ℃，相對(duì)濕度：40%～60%。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物可以自由飲水并喂養(yǎng)普通飼料（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。按完全隨機(jī)法隨機(jī)分為6 組：模型組20 只、京萬紅陽性對(duì)照組20 只、五谷麒麟膏高、中、低藥物濃度組20 只，另設(shè)20 只為正常對(duì)照組。適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周，待體質(zhì)量達(dá)80～200g 左右后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物與制劑 五谷麒麟膏組分為：五谷蟲30 g、血竭（又名血麒麟）30 g、紫草15 g、蛋黃油、麻油等。制備所需中藥均來自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房。制作方法先將五谷蟲粉、紫草倆兩味入混合油內(nèi)浸3d，然后文火熬枯去渣。再入血竭化盡，次入白蠟微火化開，待油溫后，再入研細(xì)輕粉攪勻，冷卻后即凝成膏。五谷麒麟膏含藥劑量分組：五谷麒麟膏低濃度組：10%濃度；五谷麒麟膏中濃度組：20%濃度；五谷麒麟膏高濃度組：40%濃度。京萬紅軟膏采用由天津達(dá)仁堂二藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。凡士林采用商丘市偉康醫(yī)用品廠生產(chǎn)的白凡士林，每瓶400 g。

1.1.3 試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 Bcl-xl 試劑盒（貨號(hào)2764 s，購自CST）；Bak 試劑盒（貨號(hào)bs-1284R，購自Bioss）；蘇木素試劑盒（貨號(hào)H9627，購自Sigma）；伊紅Y（水溶性）試劑盒（貨號(hào)71014544，購自國藥集團(tuán)）；脫水機(jī)（武漢俊杰JT-12J 電腦生物組織脫水機(jī)）；蠟塊包埋機(jī)；病理切片機(jī)（德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)）；切片刀（日本羽毛R35 一次性刀片）；組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰JK-6 生物組織攤烤片機(jī)）；載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；顯微鏡（奧林巴斯BX53 型生物顯微鏡）；抗原修復(fù)用電陶爐（SKG）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用付小兵等方法制造污染性傷口愈合的動(dòng)物模型，制造模擬肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的動(dòng)物模型[5-6]。將實(shí)驗(yàn)組、京萬紅組、模型組大鼠背部手術(shù)區(qū)域備皮，并用5%水合氯醛溶液（0.007 mL/g）腹腔注射麻醉，碘伏棉球常規(guī)消毒，剪去邊長為3.0 cm 大小方形皮膚，破壞皮膚全層及皮下淺筋膜直至肌層，止血后將大鼠糞便混懸液淋灑在傷口表面。創(chuàng)面部位敷以創(chuàng)面相應(yīng)大小的油紗敷料，用紗布包扎以止血，24 h 后去除覆蓋物。每日傷口淋灑糞便混懸液，72 h 后見傷口有膿性分泌物，滲液較多，創(chuàng)緣皮色發(fā)紅，即造模成功。此時(shí)創(chuàng)面為一個(gè)“急性、開放、滲血、感染”創(chuàng)面，類似于臨床肛瘺術(shù)后的創(chuàng)面。

1.2.2 給藥方法 制作傷口模型成功后，模型組大鼠的創(chuàng)面外敷凡士林0.2 g；陽性藥物京萬紅組外敷京萬紅0.2 g；治療組五谷麒麟膏高、中、低濃度各組分別外敷五谷麒麟膏高、中、低濃度藥膏，每個(gè)創(chuàng)面0.2 g，分組喂養(yǎng)。每日下午定時(shí)換藥1 次，正常對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，未做任何治療。

1.2.3 取材 用藥后3 d、7 d、11 d、15 d，用透明薄

膜緊密敷貼于創(chuàng)口上，用較細(xì)記號(hào)筆畫出傷口的邊緣，然后將透明薄膜平鋪在ECG 紙上，計(jì)算出創(chuàng)面面積數(shù)值（cm2）[7]。在無菌條件下取創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生肉芽組織，洗去表面血液然后固定于10%中性福爾馬林溶液。后經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋制成蠟塊，并連續(xù)4 um 切片以備后期使用。

1.2.4 檢測指標(biāo)和方法 一般情況：每次換藥時(shí)，通過目視檢查記錄大鼠生命體征和傷口，包括大鼠的喂養(yǎng)和活動(dòng)情況，傷口的顏色和質(zhì)地，及滲液、周圍組織水腫、痂皮等情況[8]。

創(chuàng)面愈合率：第n 天傷口愈合百分比（%）=（原始傷口面積-第n 天傷口面積）/原始傷口面積×100%[9]。在術(shù)后第3、7、11、15 天測量并記錄傷口面積大小，并計(jì)算傷口愈合百分比。其中術(shù)后第1 天的傷口面積為原始傷口面積。

創(chuàng)面組織學(xué)觀察：將切好的蠟片常規(guī)HE 染色后光學(xué)顯微鏡觀察新生毛細(xì)血管數(shù)。

免疫組化檢測Bcl-xl/Bak 比值：采用免疫組化SAP（堿性磷酸酶法）方法進(jìn)行免疫組化染色。光學(xué)顯微鏡下拍照后用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件半定量分析Bcl-xl 及Bak 的值，然后計(jì)算Bcl-xl/Bak比值。

細(xì)胞凋亡率：采用TUNEL 法進(jìn)行染色。光學(xué)顯微鏡下拍照后用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件定量分析細(xì)胞凋亡數(shù)及細(xì)胞總數(shù)。第n 天細(xì)胞凋亡率（%）=細(xì)胞凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)數(shù)資料。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示多組間樣本均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較用配對(duì)t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后當(dāng)天各組大鼠進(jìn)食較少，此后各組大鼠進(jìn)食均有所增加，3-10 d 京萬紅組及實(shí)驗(yàn)組各大鼠的進(jìn)食及活動(dòng)情況均優(yōu)于模型組；3-7 d 實(shí)驗(yàn)組各大鼠創(chuàng)面肉芽新鮮紅活，局部滲液較多，京萬紅組大鼠創(chuàng)面顏色淡紅，傷口滲液較多，模型組大鼠創(chuàng)面顏色淡白，局部滲液較少；7-15 d各組大鼠創(chuàng)面開始結(jié)痂，分泌物逐漸減少，其中實(shí)驗(yàn)組大鼠傷口痂皮較厚，范圍較大，京萬紅組次之，模型組較差。正常組無陽性癥狀。

2.2 各組大鼠不同時(shí)期創(chuàng)面愈合率比較 創(chuàng)面愈合率可直接反映大鼠傷口愈合程度，進(jìn)而反映不同藥膏對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組及京萬紅組大鼠創(chuàng)面愈合率均優(yōu)于模型組，且高濃度組愈合率優(yōu)于中濃度組，中濃度組優(yōu)于京萬紅組與低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），京萬紅組與低濃組間無明顯差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)期創(chuàng)面愈合率比較（

表1 各組大鼠不同時(shí)期創(chuàng)面愈合率比較（

注：與模型組相比，aP＜0.05；與京萬紅組相比，bP＜0.05；與低濃度組相比，cP＜0.05；與中濃度組相比，dP＜0.05

2.3 創(chuàng)面組織學(xué)觀察在傷口愈合過程中，肉芽組織形成和傷口收縮是創(chuàng)面愈合的重要環(huán)節(jié)。肉芽組織主要由毛細(xì)血管、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞所組成[8]。組織切片后常規(guī)HE 染色，通過觀察400 倍鏡下新生毛細(xì)血管數(shù)量可判斷創(chuàng)面肉芽組織生長情況，間接反映不同藥物促進(jìn)創(chuàng)面愈合的程度。見圖1。

圖1 用藥后11d 各組大鼠創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)量

2.4 Bcl-xl/Bak 比值 模型組大鼠創(chuàng)面肉芽組織中Bcl-xl 及Bak 蛋白表達(dá)均低于陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，且Bcl-xl/Bak 比值最高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高濃度組Bcl-xl 及Bak 蛋白表達(dá)最高，Bcl-xl/Bak 比值最低，中濃度組次之，低濃度組高于中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低濃度組與京萬紅組無明顯差異，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同時(shí)期創(chuàng)面肉芽組織中Bcl-xl/Bak 比值

注：與模型組相比，aP＜0.05；與京萬紅組相比，bP＜0.05；與低濃度組相比，cP＜0.05；與中濃度組相比，dP＜0.05

圖2 用藥后11d 大鼠創(chuàng)面Bcl-xl 及Bak 表達(dá)情況

2.5 細(xì)胞凋亡率 用藥后第3 d 各組大鼠創(chuàng)面細(xì)胞凋亡率無明顯差異；第7、11 d 細(xì)胞凋亡率明顯增加，其中第11 d 凋亡率達(dá)到最大，且實(shí)驗(yàn)組均高于模型組；第15 d 各組細(xì)胞凋亡率降低，且實(shí)驗(yàn)組凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低濃度組與京萬紅組無明顯差異。見表3、圖3。

表3 各組大鼠不同時(shí)期細(xì)胞凋亡率比較，%）

表3 各組大鼠不同時(shí)期細(xì)胞凋亡率比較，%）

注：與模型組相比，aP＜0.05；與京萬紅組相比，bP＜0.05；與低濃度組相比，cP＜0.05；與中濃度組相比，dP＜0.05

圖3 用藥后11 d 大鼠創(chuàng)面Bcl-xl 及Bak 表達(dá)情況

3 討論

肛瘺是肛管直腸與肛門周圍皮膚之間的異常通道，也稱為肛管直腸瘺[10]。由于其特殊的病變部位和病理改變，肛瘺多需手術(shù)治療。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面一般為開放性傷口，易受糞便污染，因此傷口愈合緩慢是臨床中較為棘手的問題[9]。中醫(yī)藥在創(chuàng)面愈合方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢，尤其對(duì)創(chuàng)傷后期的愈合起著十分顯著的作用[11]。因此，開發(fā)能加速創(chuàng)面修復(fù)及縮短愈合時(shí)間的藥物具有重要的臨床及社會(huì)價(jià)值。

中醫(yī)藥在促進(jìn)傷口愈合方面有著悠久的歷史。早在戰(zhàn)國時(shí)期的《周禮·天官》就已有記載：“瘍醫(yī)掌腫瘍、潰瘍、金瘍、折瘍”，說明此時(shí)的瘍醫(yī)已經(jīng)掌握了治療瘡瘍的方法，如理氣、活血、解毒、利濕中藥內(nèi)服，結(jié)合去腐生肌等中藥外用。關(guān)于“煨膿長肉”的討論，首次出現(xiàn)在申斗垣《外科啟玄·明瘡瘍宜貼膏藥論》中：“在凡瘡毒已平，膿水來少，開爛已定，…至此強(qiáng)壯諸瘡，豈能致于敗壞乎？”[12]。五谷麒麟膏是我們?cè)谇捌凇办心撻L肉”法理論研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過查閱大量的相關(guān)文獻(xiàn)以及結(jié)合我們的臨床經(jīng)驗(yàn)所研制的外用油膏[13]。主要成分有：五谷蟲、血竭、紫草等。五谷蟲，味咸，性寒，歸脾、肺經(jīng)，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為五谷蟲具有抑菌、抗炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等作用，臨床可用于創(chuàng)面愈合，關(guān)節(jié)炎等[14-15]。血竭，又名血麒麟，味甘、咸，性平，歸心、肝經(jīng)，現(xiàn)代醫(yī)藥研究發(fā)現(xiàn)血竭主要含有黃烷類、三萜類等成分，包括：血竭紅素和血竭素等，它具有止血、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)組織愈合等藥理作用[16]。紫草，味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)。紫草中含有萘醌類，單萜苯酚及苯醌類等多種化學(xué)成分，其藥理作用主要體現(xiàn)在促進(jìn)傷口愈合、抗流感病毒、抗腫瘤、抗癌等方面[17]。

創(chuàng)面愈合是人體內(nèi)一系列正常的病理生理過程，是指組織因創(chuàng)傷或其他原因而受損或離斷，局部組織通過再生、重建得到修復(fù)[18]。該過程由主要有炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及多種細(xì)胞因子共同參與并互相調(diào)控而完成[19]。細(xì)胞增殖在創(chuàng)面愈合過程中的作用已被研究得深入且透徹。目前，細(xì)胞凋亡在創(chuàng)面愈合方面是研究的熱點(diǎn)話題。細(xì)胞凋亡是生命的基本現(xiàn)象，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡。細(xì)胞凋亡是多基因參與、控制的過程，包括Bcl-2 家族、Caspase 家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53 等，這些基因在種屬之間非常保守。其中凋亡相關(guān)蛋白中的Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其抗凋亡和促凋亡成員協(xié)同作用，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡“開關(guān)”的作用。在眾多凋亡途徑中，線粒體途徑是主要的內(nèi)在途徑，在此途徑中Bcl-2 家族起著相當(dāng)重要的作用。Bcl-2 家族分2 類，其中凋亡抑制基因有Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-W 等，凋亡促進(jìn)基因有Bax、Bak、Bcl-Xs、Bax、Bik/Nbk、Bid 等[20]。Bcl-xl/Bak 的比值決定組織受到創(chuàng)傷后組織修復(fù)的快慢。此值越小則細(xì)胞趨于存活，創(chuàng)面愈合越快；值越大則細(xì)胞趨于凋亡，創(chuàng)傷修復(fù)較慢[21]。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)面肉芽組織中Bcl-xl/Bak>1，且高濃度組的比值最低，中濃度組次之，低濃度組高于中濃度組，低濃度組與京萬紅組無明顯差異，說明高濃度組創(chuàng)面愈合最快，模型組最慢，故該藥膏可加速創(chuàng)面的愈合，且以高濃度組最優(yōu)。

本次研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠創(chuàng)面中Bcl-xl及Bak 的表達(dá)均高于模型組，且Bcl-xl/Bak 比值優(yōu)于模型組。由此表明五谷麒麟膏能通過調(diào)控創(chuàng)面肉芽組織中Bcl-xl/Bak 的表達(dá)，抑制創(chuàng)面肉芽組織細(xì)胞的過度凋亡，加速各創(chuàng)傷細(xì)胞的修復(fù)，進(jìn)而對(duì)創(chuàng)面愈合發(fā)揮治療作用。該油膏具有緩解止痛、止血、促進(jìn)傷口愈合的良好效果?？梢詫⑽骞洒梓敫嘤糜谂R床肛瘺術(shù)后創(chuàng)面促愈，并且有較好的推廣應(yīng)用前景。