林海丹，陳銘泰，莊震坤，張 忠△，劉彩如

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳市中醫(yī)院心血管科，廣東 深圳518100；）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管意外的基本病理基礎(chǔ)。其形成發(fā)展與凋亡基因密切相關(guān)。大量研究表明，控制動(dòng)脈粥樣硬化甚至逆轉(zhuǎn)其發(fā)展趨勢(shì)，可以減少急性心腦血管事件意外發(fā)生。AS 主要為血管內(nèi)膜發(fā)生脂質(zhì)等物質(zhì)沉積，中層血管平滑肌增殖遷移，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，從而形成粥樣病變[1-2]。Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 等基因在該病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同分組的ApoE 基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的Orai1、Caspase、Bax、Bcl-2 基因及其對(duì)應(yīng)的蛋白，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行基因及蛋白研究，為溫腎化痰方調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化提供基因及蛋白層面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、飼料與藥物 6 周齡ApoE-/-小鼠，均為雄性，體質(zhì)量20～30g，SPF（Specific pathogen Free，SPF）級(jí)，實(shí)驗(yàn)前普通飼料喂養(yǎng)1 周。高脂、高膽固醇飼料含1%膽固醇及5%豬油。溫腎化痰方：仙茅10 g，仙靈脾10 g，石菖蒲15 g，瓜蔞皮15 g，乳香15 g 加工制成含生藥0.5265 g/mL 中藥濃縮液，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供。陽(yáng)性對(duì)照藥為阿托伐他汀鈣片（20 mg/片，輝瑞制藥有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組與給藥 將ApoE-/-小鼠120 只按體重分層隨機(jī)法，平均分為6 組，分別為空白對(duì)照組、易損斑塊組、陽(yáng)性對(duì)照組、低、中、高劑量中藥組。普通飼料喂養(yǎng)空白對(duì)照組12 周。高脂、高膽固醇飼料喂養(yǎng)剩余5 組小組8 周后繼而予高脂飼料喂養(yǎng)4周。空白對(duì)照組及易損斑塊組小鼠均不給藥，予生理鹽水1 mL/d 灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組予阿托伐他汀鈣喂養(yǎng)5 mg/kg·d-1，低、中、高劑量中藥組分別予溫腎化痰方5.256 g/kg·d-1、10.053 g/kg·d-1、20.106 g/kg·d-1喂養(yǎng)，以上藥液均在8 周后開始灌胃給藥4 周。

1.3 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 配制Tris-甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠及濃縮膠后，稱取組織后裂解離心，取上清液，用BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行組織蛋白定量，將定量裂解后的樣品取100 μL 加入5X 蛋白上樣緩沖液25 μL 混勻。電磁爐煮沸處理15 min，冷卻后待用。

Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)：將樣品滴加到凝膠孔內(nèi)電泳；轉(zhuǎn)膜；取膜放置脫脂奶粉（濃度5%）封閉孵育；結(jié)束后PBST 洗膜；再加入用PBS 含1%的BSA 為稀釋液的一抗搖床振蕩孵育1 h；孵育結(jié)束后PBST 洗膜；加入HRP 標(biāo)記的二抗振蕩孵育1 h；孵育結(jié)束后PBST 洗膜；ECL 發(fā)光顯影，定影。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 RT-PCR 檢測(cè)mRNA 表達(dá) 樣品研磨成粉后于離心管中反復(fù)振蕩裂解，加入Trizol 吹打裂解；加入氯仿劇烈震蕩1 min 后靜置5 min 后12 000r 離心10 min；取上清液移至異丙醇EP 管中混勻離心10 min；去上清，加入乙醇離心5 min，去上清；干燥后DEPC 溶解；與DNaseⅠ等配置反應(yīng)液；加苯酚后離心；再取上清液加氯仿后離心；再取上清液后加異丙醇靜置、離心、去上清；乙醇洗滌、風(fēng)干；加DEPC 溶解；在PCR 管中加入RNA、引物混合物70℃保溫10 min 后迅速在冰上冷卻2 min；加入RNA/引物變性溶液等試劑后42 ℃保溫60 min、72℃保溫15 min、-20℃保存?zhèn)溆?；cDNA 稀釋10 倍；加入引物、ddH2O 等配制反應(yīng)體系；使用PRIMER5 軟件/NCBI 在線設(shè)計(jì)引物；使用ViiA7 software 設(shè)定反應(yīng)條件并分析基因擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組之間的比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 各蛋白條帶灰度情況

表1 各蛋白相對(duì)灰度值

2.1 用藥前后各組蛋白表達(dá)情況 給藥4 周后，各組條帶灰度情況如下（見(jiàn)圖1 及表1）。各組小鼠內(nèi)參蛋白條帶基本一致，即各組小鼠樣品上樣量基本一致。與空白對(duì)照組相比，易損斑塊組的Orail1、Caspase3、Caspase9、Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，BCI-2 蛋白表達(dá)則下調(diào)明顯，表明易損斑塊組的促進(jìn)凋亡的相關(guān)蛋白增加，抑制凋亡的BCI-2 蛋白減少。與易損斑塊組相比，余5組的Orail1、Caspase3、Caspase9、Bax 蛋白表達(dá)下調(diào)，且中藥劑量越大，下調(diào)程度越明顯，表明溫腎化痰方能下調(diào)促凋亡的相關(guān)蛋白的表達(dá)；同時(shí)余5 組的BCI-2 蛋白表達(dá)上調(diào)，且上調(diào)程度隨中藥劑量增加而增加，即表明溫腎化痰方能上調(diào)抑制凋亡的BCI-2 蛋白表達(dá)。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，溫腎化痰方各劑量組下調(diào)促凋亡的相關(guān)蛋白及上調(diào)抑制凋亡的相關(guān)蛋白的作用一致。且其作用隨中藥劑量的增加而增強(qiáng)。高劑量中藥組作用與陽(yáng)性對(duì)照組條帶基本一致，說(shuō)明高劑量溫腎化痰方的作用與阿托伐他汀鈣作用基本一致。

2.2 各組大體標(biāo)本情況

圖2 各組大體標(biāo)本情況

2.3 用藥前后各組mRNA 表達(dá)情況 給藥4 周后，各組基因相對(duì)樣品模板量見(jiàn)表2。

表2 各組基因相對(duì)樣品模板量結(jié)果比較

表2 各組基因相對(duì)樣品模板量結(jié)果比較

各組基因相對(duì)樣品模板量2-△△CT相比結(jié)果顯示：易損斑塊組的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 含量均比空白對(duì)照組明顯上升，而Bcl2 含量比空白對(duì)照組明顯下降，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax、及Bcl2 含量與空白對(duì)照組相比基本一致，統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異（P>0.05）。各中藥組的Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 含量與易損斑塊組相比，隨中藥劑量增加而下降，而Bcl2 含量則隨中藥劑量增加而增加。其中高劑量中藥組與陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，其各組基因含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性退行性改變，由脂質(zhì)等物質(zhì)沉積管壁，引起細(xì)胞吞噬并泡沫化，進(jìn)而血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移，從而導(dǎo)致管壁硬化、管腔變細(xì)等病理性改變[1-2]。Orail 是質(zhì)膜上的控制Ca2+流通的跨膜蛋白，在血管平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)[3-4]。其在被激活狀態(tài)下構(gòu)建鈣釋放激活鈣通道，從而調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡[5-7]。研究表明，Orail 與動(dòng)脈斑塊硬化發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用[8]。Bax 屬Bcl-2 家族成員，在細(xì)胞凋亡中也起到促進(jìn)作用，尤其促進(jìn)不穩(wěn)定型粥樣斑塊的增生[9-10]。Bax 促進(jìn)平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，釋放炎性因子，加重炎性反應(yīng)，同時(shí)細(xì)胞碎片促進(jìn)血栓形成，影響斑塊穩(wěn)定[10-11]。而Bcl-2 是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控原癌基因，主要參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程，作用與Bax 相反，即主要阻止Caspase9 及后續(xù)的Caspase3 的一系列活化，從而促進(jìn)細(xì)胞生存，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12-15]。Caspase3、Caspase9 均屬Caspase 家族中促凋亡的基因及相對(duì)應(yīng)的酶。Caspase 家族屬半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡中是多條凋亡機(jī)制通路的核心匯聚點(diǎn)，其中Caspase9 起啟動(dòng)作用，而Caspase3 起效應(yīng)作用，且Caspase3 活性最高，特異性徹底裂解底物使細(xì)胞最終凋亡[16-18]。

大量研究表明，ApoE（載脂蛋白E）的基因多態(tài)性與血脂異常、動(dòng)脈粥樣硬化有密切的相關(guān)性[19-21]。為排除ApoE 基因干擾，本實(shí)驗(yàn)選用ApoE 基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型，觀察溫腎化痰方對(duì)小鼠相關(guān)促進(jìn)或抑制斑塊形成的基因及其蛋白的影響。溫腎化痰方由廣東省名中醫(yī)羅陸一教授根據(jù)經(jīng)典名方二仙湯結(jié)合個(gè)人經(jīng)驗(yàn)及科研成果加減化裁而來(lái)，由仙靈脾、仙茅、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香等藥味組成。其中仙靈脾辛溫，歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)腎強(qiáng)骨；仙茅辛溫，入腎，溫腎壯陽(yáng)；石菖蒲辛苦溫，歸心胃經(jīng)，化濕豁痰，活血理氣；瓜蔞皮甘寒，歸肺胃經(jīng)，化痰利氣寬胸；乳香辛苦溫，活血止痛。全方有活血化瘀、溫腎助陽(yáng)的功效。課題組認(rèn)為本病為年老腎陽(yáng)衰微，痰瘀阻滯，故發(fā)本病，當(dāng)以溫腎化痰為法，故以此方為實(shí)驗(yàn)治療方。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，與易損斑塊組相比，溫腎化痰方可明顯下調(diào)Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 的基因及蛋白表達(dá)。表明溫腎化痰方可通過(guò)降低促凋亡基因的表達(dá)及相應(yīng)蛋白的激活及表達(dá)，從而降低細(xì)胞凋亡及增殖的幾率，延緩甚至改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。同時(shí)溫腎化痰方可上調(diào)Bcl-2 的基因及蛋白表達(dá)。表明溫腎化痰方可增加抑制細(xì)胞凋亡的基因表達(dá)，截?cái)郈aspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而減少平滑肌細(xì)胞的凋亡及增殖，正向抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。高劑量中藥組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異，表明高劑量溫腎化痰方調(diào)節(jié)相關(guān)基因及蛋白的作用與阿托伐他汀鈣一致，但要注意劑量問(wèn)題。從這方面又可表明中醫(yī)藥的療效與劑量有密切關(guān)系。溫腎化痰方如何調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，通過(guò)何種或多種組分如何進(jìn)行藥理反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中尚未可知，具體藥理機(jī)制需待進(jìn)一步研究。

綜上所述：溫腎化痰方可通過(guò)調(diào)節(jié)與血管平滑肌細(xì)胞的凋亡、增殖相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)，從基因?qū)用娼档脱芷交〖?xì)胞的凋亡率，改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及發(fā)展，從而起到保護(hù)心血管的作用。