王 波，陳 潛，劉 淦，盧 瑩，周 歡，楊進孫，孫恩濤

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 檢驗學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 感染性疾病科，安徽 蕪湖 241001)

登革熱由正鏈RNA登革病毒引起[1]，通過感染的埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播，于2013年被列為全球最重要的蟲媒傳染病之一[2]。登革熱可由5種與基因有關(guān)的登革病毒血清型(DENV Ⅰ～Ⅴ)中的任何一種傳染[3]。血清型Ⅰ～Ⅴ型依據(jù)E蛋白抗原性分類[4]，同一種登革熱血清型的感染能提供長期的同型免疫，但只能提供暫時性的異型保護[5]。登革病毒血清型的分型在臨床治療和流行病學(xué)研究方面都具有其重要意義。本研究對1例輸入性登革熱患者的臨床資料和實驗診斷進行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病史 患者，男，50歲，安徽蕪湖人。患者自訴2018年8月27日在孟加拉期間，當?shù)匚米语w入口中，9月3日患者回國途中突發(fā)高熱，達40℃,發(fā)熱期間無皮疹出血，無頭痛和全身酸痛。當?shù)厣鐓^(qū)醫(yī)院輸液治療效果不佳仍有低熱。9月7日于弋磯山醫(yī)院就診，有咳嗽癥狀，無明顯咳痰,出現(xiàn)腹痛、腹瀉，腹瀉約3～4次/天，稀便，全身乏力，納差。

1.1.2 體格檢查 T 37.7℃，F(xiàn) 68次/分鐘，R 16次/分鐘，BP 112/74 mmHg，體質(zhì)量80 kg。發(fā)育正常，營養(yǎng)可，步入病室，神志清，精神欠佳，查體合作，對答切題。全身皮膚及黏膜無黃染，無皮疹。未見皮下出血，無肝掌，未見蜘蛛痣。

1.1.3 輔助檢查 血常規(guī):白細胞3.4×109/L，中性粒細胞79.9%,紅細胞4.47×109/L,血小板80×109/L，胸片示基本正常，擬診“登革熱”。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 病毒RNA提取 選用德國QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(貨號：52906)提取RNA，并進行病毒核酸檢測。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-巢氏PCR 以8 μL病毒RNA為模板，選用天根生化科技有限公司的FastKing RT Kit(With gDNase)試劑盒(目錄號：KR116)，合成cDNA。巢氏PCR以上述cDNA為模板，參照文獻[6]的反應(yīng)體系和程序。引物序列見表1。

表1 登革病毒通用和血清分型引物

引物引物序列(5′→3′)擴增片段大小bp型特異性DVFTCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG通用DVRTTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC511(DVF和DVR)通用DV1 RCGTCTCAGTGATCCGGGGG482(DVF和DV1R)Ⅰ型DV2 RCGCCACAAGGGCCATGAACAG119(DVF和DV2R)Ⅱ型DV3 RTAACATCATCATGAGACAGAGC290(DVF和DV3R)Ⅲ型DV4 RCTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA392(DVF和DV4R)Ⅳ型

1.2.3 結(jié)果判斷 取4 μL巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果是否出現(xiàn)條帶，再比對陽性條帶與Ⅰ～Ⅳ型擴增片段大小是否有一致，若沒有一致則為陰性。

1.2.4 基因克隆測序分析 將巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進行克隆，陽性單克隆菌液送往上海生工有限公司測序，測序結(jié)果于NCBI上比對分析。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果 巢氏PCR結(jié)果顯示480 bp左右見一陽性條帶(圖1)。結(jié)合登革病毒通用和血清分型引物擴增片段大小，證實此次輸入性登革熱病例，且登革病毒血清型為I型。

M.marker;1.陰性對照;2.患者標本。

圖1 患者巢氏PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖

巢氏PCR反應(yīng)產(chǎn)物測序結(jié)果通過NCBI上BLIST比對，歸屬為DENV-I。

2.2 診療經(jīng)過及療效 確診登革熱感染后給予完善檢查，治療上予以抗病毒、抗感染、補液等對癥治療。2018年9月11日血常規(guī)示：血小板16×109/L，為防止出血，給予輸注A(+)血小板1個治療量，輸入過程順利，患者無寒戰(zhàn)、皮疹、惡心等特殊不適。為防止出血，9月13日再次給予輸入A(+)血小板2個治療量，輸入過程順利，患者無特殊不適。

3 討論

登革熱的診斷主要依賴于臨床癥狀的識別、血清學(xué)的確認以及患者的流行病學(xué)資料。目前，登革熱的診斷通常是根據(jù)患者是否符合世衛(wèi)組織定義的臨床特征。這一定義具有一定的靈敏度但特異度較低[7]，存在一定的局限性，尤其是對于老年人的診斷。在世衛(wèi)組織所列的登革熱分類計劃的癥狀中，登革熱病例所符合的概率很高，因此，在應(yīng)用于早期診斷時具有較高的靈敏度。然而，如肌痛、關(guān)節(jié)痛、黏膜出血等顯示住院和重癥登革熱風(fēng)險增加的癥狀在老年人中很少有報道，這一趨勢降低了世衛(wèi)組織分類辦法對老年人的敏感性。研究表明，隨著患者年齡的增加，臨床對登革熱的診斷變得更加困難[8]。同時登革病毒血清型間抗原特異性差異大，交叉免疫復(fù)雜[9]，且各血清型病毒毒力不一[10]。一種血清型的原發(fā)性感染只對感染的血清型提供終身免疫，但在再次感染另一種血清型時，反而會增加患者重癥登革熱疾病的風(fēng)險[11]。

在我國，登革熱主要流行于北緯29°以南的東南沿海地區(qū)，存在輸入性病例和本地感染病例兩種流行形式。輸入性病例常年存在[12]，病例主要來源于東南亞和南亞[13]，而本次輸入性病例來源地孟加拉正屬于南亞地區(qū)。登革熱在中國大陸的流行受地域和季節(jié)的限制，仍是一種輸入性疾病，不被確認為地方病[14]。同時由于目前還沒有針對登革熱特定的治療藥物或者獲得許可的疫苗[15]，遏制登革熱傳播的有效措施主要是抑制媒介種群和避免接觸傳染源。因此輸入性病例的早期監(jiān)測和分析，進而確定高風(fēng)險地區(qū)和季節(jié)，對于規(guī)劃登革熱預(yù)防和控制的資源分配有重要意義。還可以利用監(jiān)測數(shù)據(jù)建立登革熱預(yù)警系統(tǒng)，為登革熱控制政策的影響和公共衛(wèi)生干預(yù)提供重要證據(jù)。

在本次輸入性登革熱病例的實驗診斷和分析中，成功確診該患者為登革熱感染且確定其血清型分型為Ⅰ型。通過兩對嵌套式引物的使用，極大提高了其檢查的特異度和靈敏度，彌補了依賴臨床癥狀診斷的不足。巢氏PCR檢測不僅能夠準確快捷地診斷登革病毒感染，檢測血清分型，還能夠通過對PCR產(chǎn)物測序，進行病毒血清型和基因多態(tài)性的分析，對于把握登革熱流行的基本規(guī)律和風(fēng)險評估具有重要意義。