方 潔，鄧雅欣，王鵬宇，陳 曦，邵德翠，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽 蕪湖 241002)

近年來，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者的人數(shù)持續(xù)增長，據(jù)估計(jì)到2030年全球糖尿病患者人數(shù)將達(dá)到4.39億[1]。 2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)占糖尿病發(fā)病率的90%以上，它可以損害神經(jīng)系統(tǒng)致患者認(rèn)知能力下降[2-3]。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)是導(dǎo)致DM的重要因素,體內(nèi)積聚過多的AGE可引起糖尿病的各種并發(fā)癥。氨基胍(AG)作為AGE的抑制劑通常用于治療糖尿病大鼠的心血管疾病[4]。目前有學(xué)者開始將AG用于治療糖尿病大鼠的認(rèn)知障礙，研究表明AG可改善糖尿病大鼠的認(rèn)知功能，但其具體機(jī)制仍在不斷探索中[5-6]。離子型谷氨酸受體(iGluR)參與神經(jīng)退行性疾病和精神疾病的發(fā)展過程[7]，α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸受體(AMPA受體)作為iGluR的一種亞型，在記憶形成中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)多種因素與糖尿病所致的認(rèn)知衰退有關(guān)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)與所有真核細(xì)胞中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的生物合成密切相關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生錯誤折疊時可引起ERS[9]。機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激時ERS被廣泛激活，并受ER伴侶蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78/Bip)控制，XBP1s的表達(dá)也隨之增加[10]。在T2DM中，高水平的AGE可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，長期處于ERS狀態(tài)下,機(jī)體胰島素抵抗進(jìn)一步加強(qiáng),從而在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用并損害多種器官組織[11-12]。因此，本研究旨在探究ERS在AG改善T2DM小鼠認(rèn)知功能中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物 雄性昆明小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，由南京青龍山動物繁殖場提供，合格證號：SCXK(滬)2013-0006。

1.2 藥品與儀器 鏈脲霉素(Streptozotocin，sigma公司，貨號V900890-1G)，氨基胍(Aminoguanidine，sigma公司，貨號A7009-100G)，GluR1抗體(上海Abcam公司，貨號ab109450)，GluR2(上海Abcam公司，貨號ab106515),血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司，ONETOUCH UltraEasy),跳臺檢測儀(ugo basile公司，實(shí)驗(yàn)箱型號Cat.No.47573,觸控屏控制器40500-001,相關(guān)應(yīng)用軟件4570-010)。

1.3 模型制備與分組 小鼠自由進(jìn)食適應(yīng)1周后隨機(jī)選擇10只小鼠作為對照組(Ctrl組)給予正常飲食，其余小鼠(模型組)給予高糖高脂飲食(HFD)。4周后，所有小鼠禁食不禁水12 h，將120 mg/kg STZ溶于pH4.25的0.1 mol/ L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中并腹腔注射于模型組小鼠，對照組小鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。尾靜脈取血測量空腹血糖(FPG)，注射7 d后FPG≥11.1 mmol/L可視為成功模型(T2DM)[13]，繼續(xù)給予模型組小鼠HFD飲食。每周測量1次FPG，4周后將模型組小鼠隨機(jī)分為兩組，即糖尿病組(DM組，n=9)和氨基胍組(AG組，n=9)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，2型糖尿病成模率一般在80%左右[14]，本實(shí)驗(yàn)造模小鼠總數(shù)30只，實(shí)際成模25只，成模后繼續(xù)飼養(yǎng)過程中因血糖過高死去7只，因體質(zhì)以及飼養(yǎng)問題對照組小鼠死去2只，最終納入統(tǒng)計(jì)小鼠為對照組8只，氨基胍組9只以及糖尿病組9只。AG組小鼠給予氨基胍(100 mg/kg)灌胃治療，其余小鼠予以等體積生理鹽水灌胃[15-16]。

1.4 跳臺實(shí)驗(yàn)檢測小鼠行為學(xué)認(rèn)知能力 第1天，給予小鼠3 min訓(xùn)練。將小鼠置于平臺上，使平臺振動(10Hz)。如果小鼠離開平臺(即為錯誤行為)它們將受到電擊(0.5 mA)懲罰。訓(xùn)練期間，記錄第1次離開平臺的時間(潛伏期)和錯誤的次數(shù)。第2天重復(fù)第1天的實(shí)驗(yàn)，并記錄潛伏期和錯誤次數(shù)。在第3天，檢測其學(xué)習(xí)結(jié)果。所有的設(shè)置都固定不變，只是不給電擊，同樣記錄它們的潛伏期和錯誤次數(shù)[3]。

1.5 Western blot 跳臺實(shí)驗(yàn)完成后，取出小鼠大腦。左腦分離海馬保存于-80℃冰箱用于Western blot。海馬組織中加入等量組織裂解液研磨，離心收集上清液。等量上清液加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離與轉(zhuǎn)膜，膜在含有5%脫脂奶粉和0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽水(TBST)中封閉1 h,之后放入相應(yīng)一抗中4℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，每次10 min，之后放入對應(yīng)的二抗中孵育2 h(兔抗或鼠抗)。用TBST再次洗滌3次，每次10 min，暗室曝光。ImageJ 軟件對條帶光密度值定量分析[17-18]。

1.6 HE染色觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化 右腦用于HE染色切片觀察，4%多聚甲醛固定右腦，乙醇梯度脫水，包埋在石蠟中。制備石蠟包埋的腦切片(5 μm)，并用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下以200×和400×放大觀察右腦切片[19]。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、血糖的變化 注射STZ前，糖尿病小鼠的體質(zhì)量與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射STZ兩周后，與對照組小鼠相比，糖尿病小鼠的體質(zhì)量降低(P<0.01)并呈現(xiàn)下降趨勢。AG組小鼠體質(zhì)量高于DM組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。注射STZ后，糖尿病小鼠血糖值超過20 mmol/L，高于對照組(P<0.01)，但AG組與DM組小鼠之間血糖值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

指標(biāo)組別n注射STZ前注射STZ后2周4周6周8周Ctrl組842.4±0.945.0±1.147.7±1.247.8±1.048.0±1.2體質(zhì)量/gAG組943.5±1.639.0±1.6??40.4±2.0?38.5±1.8?36.5±1.8?DM組941.7±0.937.0±0.8?37.9±1.1?37.0±0.9?35.4±1.1?F0.6211.8711.4618.8922.93P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01Ctrl組83.8±0.24.5±0.35.1±0.46.6±0.39.3±0.3血糖/(mmol/L)AG組93.6±0.218.8±2.9?22.5±2.5?24.0±1.9?30.6±1.3?DM組93.4±0.423.9±2.6?23.1±2.6?25.5±1.6?28.6±1.8?F0.4317.4720.5647.0277.26P>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01

與Ctrl組相比：*P<0.01。

2.2 氨基胍對T2DM小鼠行為學(xué)的影響 對小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)的潛伏期(F=6.28,P<0.01)和錯誤次數(shù)(F=2.98,P=0.07)進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過兩天的訓(xùn)練學(xué)習(xí)，與Ctrl組(176.36±2.83)s相比，DM組(102.40±26.61)s的潛伏期縮短(P<0.01)，與DM組相比，AG組(169.66±5.73)s的潛伏期延長(P<0.01)(圖1A)。與Ctrl組相比(0.38±0.26)次，DM組(1.44±0.47)次小鼠的錯誤次數(shù)增多(P<0.05)次,AG組(0.44±0.24)小鼠的錯誤次數(shù)少于DM組(P=0.051)(圖1B)。

圖1 小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)潛伏期與錯誤次數(shù)的比較

2.3 氨基胍對T2DM小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的影響 用顯微鏡200× 和400× 觀察HE染色切片，在400×下可觀察到Ctrl組小鼠海馬CA1區(qū)胞質(zhì)較為豐富，細(xì)胞排列較為整齊(圖2A、B)，AG組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞質(zhì)略有減少，細(xì)胞排列較為疏松(圖2C、D)，DM組小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞排列混亂(圖2E、F)。

A.Ctrl組(200×)；B.Ctrl組(400×)；C.AG組(200×)；D.AG組(400×)；E.DM組(200×)；F.DM組(400×)。

圖2 HE染色觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變化

2.4 氨基胍對T2DM小鼠AMPA受體表達(dá)的影響 對小鼠海馬內(nèi)GluR1(F=2.25，P>0.05)和GluR2(F=5.49，P<0.05)(圖3A)，蛋白表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：與Ctrl組相比，DM組中GluR1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3B)，GluR2表達(dá)水平升高更為顯著(P<0.01)(圖3C)；與DM組相比，AG組AMPA受體表達(dá)水平呈下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 Western blot檢測小鼠GluR1、GluR2的表達(dá)水平

2.5 氨基胍對T2DM小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)水平的影響 對小鼠海馬中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Bip(F=6.12，P<0.05)和XBP1s(F=15.92，P<0.01)(圖4A)的表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：與Ctrl組相比，DM組小鼠海馬中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平較高(P<0.01，P<0.01)，經(jīng)過兩周的氨基胍治療后，與DM組相比，AG組小鼠海馬內(nèi)Bip和XBP1s蛋白的表達(dá)水平都下降(P<0.05，P<0.01)(圖4B、C)。

圖4 Western blot檢測小鼠Bip、XBP1s的表達(dá)水平

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察了AG對T2DM小鼠認(rèn)知功能的作用。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)AG治療后，糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力確有改善。HE染色切片上可觀察到與DM組相比，AG組的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列更為整齊，細(xì)胞質(zhì)也更為豐富。Western blot結(jié)果顯示，DM組小鼠AMPA受體、Bip和XBP1s表達(dá)水平升高，經(jīng)AG治療后，AG組AMPA受體水平呈下降趨勢，ERS水平下降，表明AG可通過減輕ERS來改善T2DM小鼠的認(rèn)知功能。

Yin等研究發(fā)現(xiàn)在具有認(rèn)知缺陷的自發(fā)性肥胖KK-AyT2DM小鼠中，GluR1蛋白表達(dá)下調(diào)而GluR2的表達(dá)卻上調(diào)。他們認(rèn)為GluR1亞基的減少阻礙了LTP在海馬中的表達(dá)，而GluR2亞基的上調(diào)可能是由于機(jī)體通過代償效應(yīng)減輕小鼠的認(rèn)知障礙[20]。也有相關(guān)領(lǐng)域的其他研究人員表示AMPA受體水平的上調(diào)可能是機(jī)體對認(rèn)知障礙的一種補(bǔ)償作用[21-22]。Western blot結(jié)果顯示DM組GluR1和GluR2表達(dá)水平較Ctrl組升高，經(jīng)AG治療后兩者表達(dá)水平均呈下降趨勢。GluR1和GluR2受體的上調(diào)可能是機(jī)體代償?shù)慕Y(jié)果，通過AG治療后機(jī)體的代償性應(yīng)激狀態(tài)得以改善并趨于恢復(fù)至正常水平。目前已有研究表明ERS與肥胖大鼠認(rèn)知障礙密切相關(guān)[23]，減輕ERS可改善糖尿病大鼠的認(rèn)知功能[24]。Bip和XBP1s是ERS的標(biāo)志蛋白，我們的實(shí)驗(yàn)觀察到DM組Bip和XBP1s表達(dá)水平升高，通過AG治療后兩者水平都降低，這表明ERS可能是導(dǎo)致糖尿病小鼠認(rèn)知功能受損的重要因素，而AG可以減輕ERS。AMPA受體作為檢測認(rèn)知的指標(biāo)之一，其在DM組中的表達(dá)上升可能是高水平的ERS激活機(jī)體的保護(hù)機(jī)制從而使AMPA受體代償性表達(dá)升高，但具體的機(jī)制仍不清楚。Osborne等人報(bào)道認(rèn)為AMPA受體和NMDA受體失調(diào)是飲食所致肥胖小鼠認(rèn)知障礙的原因之一，并且這種失調(diào)的具體機(jī)制因研究的不同而有所差異[21]。ERS是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制，不同信號通路的激活在細(xì)胞存活或死亡的命運(yùn)選擇上完全不同，對于AG如何通過減輕ERS改善T2DM的認(rèn)知功能以及ERS與AMPA受體的內(nèi)在聯(lián)系，我們將在離體海馬神經(jīng)元中進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AG可能通過減輕ERS來改善T2DM小鼠的認(rèn)知障礙。本實(shí)驗(yàn)為氨基胍類藥物改善糖尿病認(rèn)知障礙提供了理論支持，同時通過探究ERS與AMPA受體的表達(dá)在其改善機(jī)制中的作用也為提高T2DM認(rèn)知功能提供了一個研究方向。