符清勝，吳克盛，趙 軍，趙國海

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 胃腸外科，安徽 蕪湖 241001)

胃癌是第五位最常診斷的癌癥，也是第三大癌癥死亡原因，2018年新增病例超過100萬例，死亡人數(shù)估計(jì)為783 000人(相當(dāng)于全球每12人死亡中有1人死亡)，亞洲是胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)[1]。微小RNA(microRNA)是一類高度保守，由 18～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA，通過識(shí)別目標(biāo) mRNA 3′端非編碼區(qū)的互補(bǔ)序列，誘導(dǎo)脫腺苷化，從而抑制 mRNA的表達(dá)[2]。近期相關(guān)報(bào)道指出 miR-124 在胃癌中呈低表達(dá)，且與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，但是miR-124 對(duì)于胃癌的作用及相關(guān)機(jī)制的研究相對(duì)較少。本項(xiàng)目旨在研究miR-124在胃癌中的表達(dá)情況及其對(duì)胃癌生物功能學(xué)的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，以期為胃癌的早期診斷和分子治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌組織和距離癌腫5 cm的癌旁組織取自弋磯山醫(yī)院；人類胃癌細(xì)胞株BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；miR-124 mimics、micro Negative control(NC)(廣州銳博生物)；1640培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(Clark)；FECTTM CP 轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州銳博生物)；TRNzol(TIANGEN)；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN)，miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(TIANGEN)；BCA試劑盒(碧云天)；Antibody AKT，Antibody p-AKT(Ser473)，Antibody PI3K，Antibody p-PI3K，Antibody β-actin(CST)；使用的引物均購自銳博生物技術(shù)。引物序列為，miR-124正向：5′-GCGCCGTGTTCAGCGGACC-3′和miR-124反向：5′-GTGCAGGTCCGAGT-3′，U6正向：5′-CGCTGTCGCAGCAGCACATACTA-3′和U6反向：5′-CGCTTCTCTCACACGATTGGTGTCTCTCA。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株均在37 ℃加濕5%CO2+95%空氣的條件下，加入10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 mg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在完全1640培養(yǎng)基中分別用不同濃度miR-124 mimics、miR-NC處理細(xì)胞，采用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，最終濃度確定為100 nmol/L，轉(zhuǎn)染時(shí)間確定為24 h；轉(zhuǎn)染后BGC-823細(xì)胞miR-124表達(dá)上調(diào)最明顯，所以功能實(shí)驗(yàn)我們選擇胃癌細(xì)胞株BGC-823進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 在96孔板中接種BGC-823細(xì)胞(每孔3000細(xì)胞)，用100 nmol/L miR-124 mimics、NC處理BGC-823細(xì)胞24、48和72 h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞BGC-823的增殖情況，37 ℃時(shí)加入10 μL CCK-8(5 mg/mL)，在5%CO2和95%空氣的加濕條件下孵育2 h。然后使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、miR-NC。轉(zhuǎn)染 24 h后消化收集細(xì)胞，以5×104/孔接種于Transwell小室中。上層為 100 μL 無血清培養(yǎng)基，下層為 600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后棄去培養(yǎng)基，濕棉棒輕輕擦去小室內(nèi)細(xì)胞，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，并拍照取圖。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法同上，轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化后離心(2000 r/min，離心5 min)收集，PBS洗滌細(xì)胞兩次(2000 r/min，離心5 min)，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidium lodide混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 使用TRNzol從收集的42對(duì)胃癌組織和癌旁組織以及轉(zhuǎn)染前后的BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS、GES-1細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行 cDNA的合成(42℃反應(yīng)60 min，95℃反應(yīng)4 min)，以GAPDH為內(nèi)參，使用擴(kuò)增試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增[95℃擴(kuò)增15 min；(94℃擴(kuò)增20 s、60℃擴(kuò)增34 s×40個(gè)循環(huán)]，以2-△△ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，完成PCR。

1.2.6 Western blot 將BGC-823、SGC-7901細(xì)胞(每孔5×104個(gè)細(xì)胞)接種于6孔板中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、NC 24 h后，收集細(xì)胞加入蛋白上樣緩沖液，置入沸水中煮5 min，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，SDS-PAGE凝膠電泳后濕轉(zhuǎn)75 min至NC膜上，5%胎牛血清(BSA)室溫封閉2 h，加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT抗體或β-actin抗體， 4℃孵育14 h，TBST洗膜3次，每次5 min，置入二抗孵育1 h，再次洗膜3次，避光ECL顯影，內(nèi)參為β-actin，使用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-124在胃癌中低表達(dá) 與癌旁組織(1.14±0.27)相比，胃癌組織(0.70±0.15，t=10.14，P=0.000)中miR-124的表達(dá)降低(圖1)，其中miR-124與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系見表2。另外與GES-1相比，4株胃癌細(xì)胞株BGC-823、MGC-803、SGC-7901和AGS(0.47±0.06、0.47±0.5、0.54±0.07、0.49±0.07)的miR-124表達(dá)也降低(P<0.05)，而4株胃癌細(xì)胞之間miR-124的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

圖1 PCR檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織miR-124表達(dá)情況

表1 正常胃黏膜上皮細(xì)胞與4株胃癌細(xì)胞miR-124表達(dá)(n=3)

分組/項(xiàng)目x±sFPGES-11.02±0.0838.0120.000BGC-8230.47±0.06aMGC-8030.47±0.05aSGC-79010.54±0.07aAGS0.49±0.07a

注：與GES-1組比較，aP<0.05。

2.2 miR-124與臨床及病理參數(shù)之間的關(guān)系 miR-124表達(dá)與腫瘤的T分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度相關(guān)，其中，T3、T4期的表達(dá)較T1、T2期低，Ⅲ、Ⅳ期的表達(dá)較Ⅰ、Ⅱ期低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)低，分化程度好的較分化程度差的表達(dá)低(見表2)。

2.3 過表達(dá) miR-124抑制胃癌細(xì)胞的增殖 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24 h后，相比于miR-NC組(0.94±0.09)，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics(0.62±0.06，t=6.615，P=0.000)后，BGC-823細(xì)胞增殖能力降低(圖2)。

圖2 CCK-8檢測(cè)過表達(dá)miR-124后細(xì)胞的增殖能力(n=5)

表2 不同臨床特征的胃癌患者胃癌組織的miR-124表達(dá)

變量nmiR-124tP年齡/歲 < 60180.70±0.190.3700.713 ≥ 60240.72±0.16性別 男320.72±0.170.3160.754 女100.70±0.19T分期 T1,T290.84±0.142.5870.013 T3,T4330.68±0.17TNM分期 Ⅰ～Ⅱ150.87±0.166.2440.000 Ⅲ～Ⅳ270.62±0.10淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陽性220.60±0.105.6420.000 陰性200.83±0.16組織學(xué)分級(jí) 高、中分化140.62±0.142.6590.011 低分化280.76±0.17腫瘤大小/cm < 5200.69±0.180.7410.463 ≥ 5220.73±0.17

2.4 過表達(dá) miR-124抑制胃癌細(xì)胞的遷移 Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-124mimics后BGC-823細(xì)胞遷移的數(shù)目(53.67±12.58)低于轉(zhuǎn)染miR-NC(152.33±14.05，t=9.061，P=0.001)的細(xì)胞(圖3)。

2.5 過表達(dá) miR-124促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-124mimics后BGC-823細(xì)胞的凋亡率(8.30±0.31)高于轉(zhuǎn)染miR-NC(2.10±0.56，t=16.777，P=0.000)的細(xì)胞(圖4)。

2.6 過表達(dá)miR-124后PI3K/AKT表達(dá)量減低 Wstern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-124 mimic后，BGC-823細(xì)胞中p-AKT蛋白表達(dá)量(34.87±4.23)相對(duì)于轉(zhuǎn)染miR-NC(118.90±10.51，t=12.847，P=0.000)的細(xì)胞降低，同樣p-PI3K水平也降低(158.53±10.94vs. 71.07±4.51，t=12.802，P=0.000)(圖5)。

A.轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和miR-NC后發(fā)生遷移的細(xì)胞(SP×100)；B.兩組遷移細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=3)。

圖3 Transwell法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的遷移能力

A.轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和miR-NC后流式細(xì)胞檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡情況；B.兩組細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=3)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)過表達(dá)miR-124后胃癌細(xì)胞的凋亡情況

A．轉(zhuǎn)染miR-124 mimics后Western blot檢測(cè)磷酸化的AKT/P13K表達(dá)情況；B.轉(zhuǎn)染miR-124 mimics后磷酸化的AKT灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C.轉(zhuǎn)染miR-124 CBmimics后磷酸化的P13K灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=3)。

圖5 Wstern blot檢測(cè)相關(guān)通路蛋白AKT、PI3K的磷酸化水平

3 討論

越來越多的研究表明，在許多癌癥中miR-124的表達(dá)下調(diào)，如miR-124在肝癌中表達(dá)下調(diào)，并且通過靶向BIRC 3調(diào)節(jié)NF-κb信號(hào)通路來抑制肝癌的增殖和遷移[4]；另外Ji等[5]研究表明，miR-124在三陰性乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過度表達(dá)miR-124可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)。同樣，在胃癌中許多miRNAs在胃癌中發(fā)生了異常的改變[6]，但它們?cè)谖赴┌l(fā)生和進(jìn)展中的分子機(jī)制仍然不甚清楚。因此，探索miRNAs在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用將極大地幫助我們加深對(duì)胃癌的了解，并為其診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-124在胃癌組織中的表達(dá)相對(duì)于癌旁組織出現(xiàn)了下調(diào)，且與腫瘤的惡性程度相關(guān)。我們通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成、Transwell、流式細(xì)胞技術(shù)等多種實(shí)驗(yàn)，證明了miR-124的過表達(dá)抑制了胃癌BGC-823細(xì)胞的體外增殖和遷移，并促進(jìn)胃癌BGC-823細(xì)胞的凋亡。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-124在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已被報(bào)道在抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖方面起著重要的作用[7]。激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT是促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞死亡的重要步驟[8]。PI3K和AKT是磷酸化致癌的重要介導(dǎo)因子[9]。其中AKT是PI3K的主要下游靶點(diǎn)，磷酸化的AKT是活性形式[10]，AKT的磷酸化與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)[11]。同樣，PI3K/AKT信號(hào)通路在胃癌中也有較多的研究。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-183可靶向調(diào)節(jié)和抑制PI3K/AKT信號(hào)通路來抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。除此之外，PI3K/AKT信號(hào)通路還參與了胃癌的EMT過程，Song[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-340靶向SPP1可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制胃癌細(xì)胞的EMT，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

本研究在胃癌細(xì)胞株BGC-823中過表達(dá)miR-124后發(fā)現(xiàn)磷酸化的PI3K/AKT(p-PI3K、p-AKT)表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)，提示PI3K/AKT通路可能參與了miR-124調(diào)控胃癌細(xì)胞的生長。而PI3K通路的激活參與了抗腫瘤治療的發(fā)展，阻斷PI3K信號(hào)通路可以增強(qiáng)對(duì)這些治療的反應(yīng)[14]。本研究確定了miR-124可能調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路，提示miR-124在臨床治療中具有重要作用。