北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院（100009）徐陽 耿嘉瑋 葛永潮

北京中醫(yī)藥學(xué)會（100005）王春生

芪參活骨方為來源于北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方，具有補脾益氣，補腎壯骨，化瘀通絡(luò)的功效，主要成分有炙黃芪、黨參、骨碎補、鹿角膠等，其中黃芪為補氣之要藥，益氣化陽，骨碎補補腎健骨，活血續(xù)傷，為君藥。該方臨床上主要用于髖部疼痛、屈伸不利、腰膝酸軟等癥的股骨頭壞死患者。臨床有多年使用歷史，安全有效[1]。現(xiàn)擬將該復(fù)方制成片劑，以利于提高藥物穩(wěn)定性，便于患者服用、貯存及攜帶[2]。本研究以芪參活骨方中君藥的有效成分，即黃芪苷及柚皮苷的含量為標準，進行工藝研究，通過正交試驗、單因素試驗等，對相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)選，最終確定了芪參活骨片的最佳制備工藝[3]。

1 材料

1.1 儀器 高效液相（SPD-20A型，日本島津），UV-VIS檢測器；高效液相（Agilent1100，美國Agilent公司），蒸發(fā)光散射檢測器（2000ES，Alltech公司）；電子天平（BT125D型，d=0.01mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；電子調(diào)溫電熱套（DZTW型，北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）。

1.2 對照品、藥材與試劑 黃芪甲苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-201314）；柚皮苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110722-201613）。

炙黃芪（北京太洋樹康飲片廠，批號：20170201），骨碎補（北京太洋樹康飲片廠，批號：1704090）。

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；純凈水（娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）；甲醇、冰醋酸等其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的含量測定方法的建立 參考2015年版中華人民共和國藥典[4]方法測定，采用HPLC法測定黃芪甲苷的含量。

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為乙腈-水(32∶68)，流速為1.0mL·min-1，柱溫為25℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測（ELSD）參數(shù)：漂移管溫度105℃，載氣（壓縮空氣）流速2.7L·min-1。進樣量：對照品溶液10μl、20μl，供試品溶液20μl；理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于4000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對照品，加甲醇制成0.503mg·mL的溶液。

附表1 正交試驗因素水平表

附表2 提取工藝正交試驗結(jié)果

附表3 黃芪甲苷提取率方差分析表

附表4 柚皮苷提取率方差分析表

附表 5 驗證試驗（n=3）

附表 6 相對密度考察

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定炙黃芪藥材粉3份，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇150mL稱定重量，超聲處理45min，取出，稱重，補重，濾過，取100mL備用；重復(fù)上述提取操作，合并兩次的正丁醇液共200mL，用氨試液充分洗滌2次，每次50mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，定容，即得黃芪藥材供試品溶液，依法測定黃芪甲苷的含量。

按處方比例稱取炙黃芪、黨參和骨碎補等9味藥材，加水煎煮，濾液濾過，濃縮或稀釋至1000mL容量瓶中，搖勻，精密量取250mL藥液，離心除去不溶于水的雜質(zhì)，將離心后的上清液濃縮至25mL，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40mL，萃取液用氨試液洗滌2次，每次50mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，用甲醇復(fù)溶，定容至5mL容量瓶中，搖勻，過0.22μm微孔濾膜吸取濾液，即得（黃芪甲苷）供試品溶液，依法測定其中黃芪甲苷的含量。

2.2 柚皮苷的含量測定 參考2015年版中華人民共和國藥典[4]方法測定，采用HPLC法測定柚皮苷的含量。

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：甲醇-醋酸-水（35∶4∶65)；檢測波長283nm，流速1.0mL·min-1，進樣量10μl，理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定柚皮苷對照品，加甲醇制成60.4μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱定骨碎補粗粉3份，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30mL，稱定重量。加熱回流3小時，放冷，再稱重，補重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得骨碎補藥材供試品溶液。依法測定其中柚皮苷的含量。

按處方比例稱取炙黃芪、黨參和骨碎補等9味藥材，加水煎煮，過濾，量取濾液體積，過0.22μm微孔濾膜吸取濾液，即得（柚皮苷）供試品溶液。依法測定其中柚皮苷的含量。

2.3 提取工藝優(yōu)選 根據(jù)處方中各藥味有效成分的理化性質(zhì)，確定方中炙黃芪、黨參和骨碎補等9味藥采用水提醇沉法提取。本試驗以黃芪中黃芪甲苷含量和骨碎補中柚皮苷含量為指標成分，對該9味藥的最佳水提醇沉工藝參數(shù)進行研究。

2.3.1 水提工藝優(yōu)選 試驗采用正交設(shè)計，以黃芪甲苷提取率和柚皮苷提取率為指標，以加水倍量（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）為影響因素，每個因素選取3水平，用L9（34）表安排試驗（見附表1）。按處方比例稱取藥材，平行稱量9份，結(jié)果見附表2。黃芪甲苷提取率和柚皮苷提取率的方差分析見附表3、4。

附表 7 醇沉濃度考察

附表 8 醇沉濃度驗證

附表 9 輔料種類考察

附表 10 乙醇濃度及藥輔比的考察

附表 11 壓片工藝考察

結(jié)果：直觀分析可知，以黃芪甲苷為指標時，三因素對黃芪甲苷提取率結(jié)果影響的大小順序為A＞C＞B，從各因素水平分析，A為K3＞K1＞K2，B為K2＞K3＞K1，C為K2＞K3＞K1，方差分析結(jié)果顯示加水倍量對黃芪甲苷提取率有顯著性差異，提取時間、提取次數(shù)對黃芪甲苷提取率無顯著性差異，故選擇的最優(yōu)提取工藝為A3B2C2；以柚皮苷為指標時，三因素對柚皮苷提取率結(jié)果影響的大小順序為C＞A＞B，從各因素水平分析，A為K3＞K2＞K1，B為K1＞K3＞K2，C為K3＞K2＞K1，方差分析結(jié)果顯示加水倍量、提取時間、提取次數(shù)三因素對柚皮苷提取率均無顯著性差異，故選擇的最優(yōu)提取工藝為A3B1C3。黃芪為方中君藥，而黃芪甲苷為黃芪主要有效成分，并且考慮到實際生產(chǎn)過程中的原料損耗和人力問題，最終以黃芪甲苷提取率為依據(jù)，選擇A3B2C2為最佳提取工藝，即加水12倍、提取1.5小時、提取2次。

2.3.2 驗證試驗 為驗證該提取工藝條件的合理性，對A3B2C2進行3批驗證試驗。稱取處方量飲片，按優(yōu)選條件進行試驗，結(jié)果見附表5。結(jié)果 顯示，黃芪甲苷的提取率為86.83%、柚皮苷的提取率為79.23%，由此說明該工藝的條件合理、穩(wěn)定可行，因此，確定A3B2C2作為最優(yōu)的提取工藝。

2.3.3 醇沉工藝參數(shù)優(yōu)化 以黃芪甲苷、柚皮苷轉(zhuǎn)移率為指標，考察醇沉相對密度和醇沉濃度。

2.3.3.1 藥液濃縮相對密度考察 將按照最佳水提工藝制備藥液，提取的液分4份，每份1000mL，其中3份分別減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10（60℃）、1.10～1.15（60℃）、1.15～1.20（60℃）的清膏，加入適量95%乙醇使醇濃度達60%，4℃靜置12h，取上清液，并記錄體積，按供試品制備方法分別制備供試品。以黃芪甲苷、柚皮苷轉(zhuǎn)移率為指標，確定最佳藥液濃縮相對密度（結(jié)果見附表6）。

結(jié)果分析：直觀分析黃芪甲苷和柚皮苷的轉(zhuǎn)移率可以得到醇沉?xí)r最佳的相對密度為1.05～1.10（60℃），在此條件下黃芪甲苷和柚皮苷均有較高的保留率，故確定最佳醇沉相對密度為1.50～1.10（60℃）。

2.3.3.2 藥液醇沉濃度考察 同法制得3份體積相同的水提液，減壓濃縮至上述最優(yōu)相對密度，即1.10～1.15（60 ℃），加入適量95%乙醇使醇濃度分別達50%、60%、70%，4℃靜置12 h，取上清液，并記錄體積，以黃芪甲苷、柚皮苷轉(zhuǎn)移率為指標，確定最佳藥液醇沉濃度，結(jié)果見附表7。

結(jié)果分析：在相對密度為1.05～1.10（60 ℃），醇沉濃度為50%時，黃芪甲苷和柚皮苷均有較高的保留率，故確定最佳醇沉工藝為相對密度1.05～1.10（60℃），醇沉濃度為50%。

2.3.4 驗證試驗 為驗證該醇沉條件的合理性，按處方比例稱取藥材適量，以最優(yōu)工藝進行提取，分別取3份相同體積的提取液，濃縮至1. 05～1.10（60℃），加95%乙醇使醇濃度達50%，進行3批驗證試驗，結(jié)果見附表8。

結(jié)果顯示，該條件下黃芪甲苷和柚皮苷的轉(zhuǎn)移率分別為91.91%、96.56%，該工藝條件合理、穩(wěn)定可行。

綜合以上研究結(jié)果，確定芪參活骨片的水提醇沉工藝為：飲片加12倍量水，每次1.5小時，提取2次，合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.05～1.10（60 ℃），加乙醇至醇濃度為50%。

3 成型工藝研究

3.1 制粒方法考察

3.1.1 濕潤劑的選擇 濕法制粒常用的潤濕劑為乙醇，故選擇乙醇為潤濕劑，并考察不同乙醇濃度對制粒情況的影響。

3.1.2 輔料種類的選擇 綜合考慮藥粉、輔料性質(zhì)及經(jīng)濟因素，初步選定糊精、乳糖、可溶性淀粉三種輔料，將浸膏粉與糊精、乳糖、可溶性淀粉分別按1∶1的比例混合均勻，噴入95%乙醇制粒，以顆粒成型率、軟材性狀、制粒難易程度及顆粒的色澤、細粉、粘結(jié)情況等為評價指標，優(yōu)選輔料種類，結(jié)果見附表9。

結(jié)果可知，輔料選擇乳糖時顆粒的制粒較為容易，成型率較高，軟材性狀適宜。因此選擇乳糖為填充劑制粒。

3.1.3 輔料用量及潤濕劑乙醇濃度的優(yōu)選 提取純化工藝研究中，1000個制劑單位的干膏粉量為438g，每片約0.438g。實際生產(chǎn)中片劑片重最大0.6g，為病人最大耐受。試驗選擇藥輔比為3∶1、5∶1、7∶1進行制粒。將適量干膏粉與乳糖分別按3∶1、5∶1、7∶1的比例混合均勻，分別噴濃度為85%、90%、95%的乙醇制粒，以顆粒成型率、軟材性狀、制粒難易程度及顆粒的色澤、細粉、粘結(jié)情況等為評價指標，結(jié)果見附表10。

結(jié)果分析：由附表10可知，乙醇濃度為95%時，軟材較為松散，細粉較多，成型率不高，當乙醇濃度為90%時成型率有所改善，而當乙醇濃度為85%時，軟材易形成較硬團塊，過篩困難。對比藥輔比例不同時顆粒的成型率及制粒難易程度則發(fā)現(xiàn)，藥輔比為3∶1時制粒較為容易，成型率較高。因此選擇90%乙醇為潤濕劑，藥輔比為3∶1進行制粒。

3.2 壓片工藝考察 實驗中發(fā)現(xiàn)，由上述實驗優(yōu)選出的工藝即乳糖∶干膏粉=3∶1，潤濕劑為90%乙醇制粒、壓片后所得片劑崩解時限不達標準，因此需加入適量的崩解劑。羧甲基淀粉鈉（CMS-Na）作為優(yōu)良的崩解劑，廣泛應(yīng)用于片劑的制備工藝。試驗將進一步考察CMS-Na壓片的處方用量。

按照乳糖∶干膏粉=3∶1，乳糖和CMS-Na分別按2∶1、1∶1、1∶2的比例混合均勻，潤濕劑為90%乙醇的方法制粒、壓片。以片劑的硬度和崩解時限為考察指標，進一步確定最優(yōu)處方工藝，結(jié)果見附表11。

結(jié)果：片劑的硬度與乳糖和CMS-Na的比例關(guān)系不大，但片劑的崩解時限隨著隨著CMS-Na用量的增大而縮短，當乳糖∶CMS-Na比例為1∶1、1∶2時片劑的崩解時限均符合要求，考慮到節(jié)約成本，最終選擇乳糖∶CMS-Na比例為1∶1作為最佳壓片工藝的輔料配比。

通過上述試驗確定芪參活骨片的成型工藝為：90%乙醇為潤濕劑，以乳糖為填充劑，CMS-Na為崩解劑，輔料比為干膏粉∶乳糖∶CMS-Na=3∶1∶1，制備顆粒，加入適量助流劑硬脂酸鎂，壓片，即得。

4 討論

提取方式的選擇，處方中各藥物所含活性成分理化性質(zhì)有較大差異，炙黃芪、黨參、骨碎補和土鱉蟲等的有效成分在水中溶解度較大，為最大程度富集有效成分，故設(shè)計水提醇沉工藝路線[5]。本實驗通過實驗確立了芪參活骨片中水提醇沉工藝和制片工藝的一系列參數(shù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了有效的數(shù)據(jù)支持。

指標成分的選擇，黃芪，補氣養(yǎng)血；骨碎補，補腎強骨，續(xù)傷止痛，在芪參補骨片中起重要治療作用，黃芪甲苷可抗炎鎮(zhèn)痛、柚皮苷促進骨髓細胞增殖，并且這兩種活性成分性質(zhì)穩(wěn)定且含量較高，以其為考察指標有利于保證提取工藝與成品制劑在藥效學(xué)上的一致性。

中藥浸膏粉一般具有較強吸濕性，需加入適當?shù)妮o料降低吸濕性便于制粒。乳糖性質(zhì)穩(wěn)定，有良好的可壓性、流動性和干黏合性，本實驗選定乳糖∶浸膏粉=1∶3的用量，為芪參活骨片大生產(chǎn)提供了參考。在制粒過程中，潤濕劑乙醇的體積分數(shù)不適時，易發(fā)生軟材發(fā)黏而堵塞篩網(wǎng)的現(xiàn)象或者制得的顆粒細粉較多，顆粒成型率低的現(xiàn)象。CMS-Na為常用崩解劑，加入少量既可起崩解劑作用又可使制得的片劑有適宜的硬度和較快的溶出速度。少量助流劑可改善顆粒流動性，可保證片重差異較小。

按優(yōu)選出的工藝驗證制備的片劑成形性、硬度適宜，抗?jié)裥粤己?，且外觀完整美觀，達到大生產(chǎn)要求，為生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。