李 響，趙 彤，吳 忠，劉 瑩，王若雨

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤二科，遼寧 大連 116001

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，進(jìn)展快、生存期短，預(yù)后較差，且近些年的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。因此，尋找有效的診療途徑具有重要意義。沙培林(Sapylin)是一種由人源A組溶血性鏈球菌培養(yǎng)增殖后經(jīng)青霉素處理后的凍干制劑，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于沙培林直接作用于腫瘤細(xì)胞研究較少，有研究[2]顯示，沙培林可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SOX9屬于SRY相關(guān)基因家族，有研究證實(shí)，SOX9參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展，如胃癌、大腸癌、前列腺癌等[3-4]。胃癌中SOX9表達(dá)明顯升高，沉默其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[5]。SOX9表達(dá)抑制對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制尚未明確。因此，本研究旨在探討沙培林或SOX9 siRNA單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)胃癌細(xì)胞活力、凋亡的影響及機(jī)制，以期為胃癌的診療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器人胃癌BGC803細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco；MTT溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma；SOX9、β-catenin、cyclinD1和Bax一抗及HRP標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染BGC803細(xì)胞用質(zhì)量濃度為100 g/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，3 d換液一次，細(xì)胞為80%左右生長(zhǎng)密度時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求傳代。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，每孔2 ml(1×105ml-1)接種于6孔板，細(xì)胞為60%～70%生長(zhǎng)融合度時(shí)，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染條件和方法將設(shè)計(jì)合成的SOX9的特異性siRNA(siSOX9組)及陰性對(duì)照siRNA(NC組)轉(zhuǎn)染BGC803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，同時(shí)設(shè)置僅加入等體積脂質(zhì)體為空白對(duì)照組，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育4～6 h，更換為完全培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染的48 h收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、沙培林組(用0.5 KE/ml的沙培林處理細(xì)胞48 h)、siSOX9組(轉(zhuǎn)染SOX9的特異性siRNA 48 h)和沙培林+siSOX9組(用0.5 KE/ml的沙培林和siSOX9處理細(xì)胞48 h)。以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的BGC803細(xì)胞于96孔板，每孔100 μl，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h，按照上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，收集培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間的4組細(xì)胞，每孔加入10 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，混勻，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清，每孔中加入DMSO溶液150 μl，室溫輕輕震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A值，490 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，達(dá)70%～80%生長(zhǎng)融合的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，以1×106ml-1濃度接種至96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，按照上述分組處理細(xì)胞，收集處理至規(guī)定時(shí)間的4組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，500 μl的1×Binding buffer懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的Annexin V-FITC和PI，混勻，于室溫避光條件反應(yīng)20 min，再加入300 μl的1×Binding buffer，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blotting收集各組細(xì)胞，適量細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白與上樣緩沖液混勻，100 ℃變性5 min，取變性蛋白30 μg，每孔道等量，經(jīng)10% SDS-PAGE分離蛋白，蛋白分離后電轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜，轉(zhuǎn)好的膜用質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加一抗，即均按照1∶500稀釋的SOX9、β-catenin、cyclinD1和Bax抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL顯色，X膠片曝光，拍照。以GAPDH為內(nèi)參，Quantity軟件分析蛋白條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SOX9基因沉默效果Western blotting檢測(cè)siRNA沉默BGC803細(xì)胞SOX9表達(dá)結(jié)果顯示，siSOX9組SOX9蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而NC組SOX9表達(dá)與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1、表1)。

圖1 SOX9 siRNA轉(zhuǎn)染BGC803細(xì)胞效果Fig 1 The effect of SOX9 siRNA transfected into BGC803 cells

組別SOX9蛋白相對(duì)表達(dá)量空白對(duì)照組0.447±0.046NC組0.478±0.048siSOX9組0.103±0.012?F值85.426P值0.000

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 沙培林或siSOX9抑制BGC803細(xì)胞活力MTT檢測(cè)的各組細(xì)胞活力結(jié)果顯示，沙培林及siSOX9均可抑制BGC803細(xì)胞活力，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而沙培林+siSOX9組對(duì)BGC803細(xì)胞活力抑制作用更明顯，且與沙培林組及siSOX9組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 MTT檢測(cè)沙培林或siSOX9對(duì)BGC803細(xì)胞活力的 影響Tab 2 The effect of Sapylin or siSOX9 on cell viability of BGC803 detected by

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與沙培林+siSOX9組比較，#P<0.05。

2.3 沙培林或siSOX9誘導(dǎo)BGC803細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，沙培林組和siSOX9組細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組，而沙培林+siSOX9組細(xì)胞凋亡率顯著高于沙培林組和siSOX9組(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表3)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沙培林或siSOX9對(duì)BGC803細(xì)胞凋亡率的影響Fig 2 The effect of Sapylin or siSOX9 on cell apoptosis rate of BGC803 detected by Flow cytometry

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沙培林或siSOX9對(duì)BGC803細(xì)胞凋亡 率的影響Tab 3 The effect of Sapylin or siSOX9 on cell apoptosis rate of BGC803 detected by Flow cytometry

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與沙培林+siSOX9組比較，#P<0.05。

2.4 沙培林或siSOX9下調(diào)BGC803細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路Western blotting檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)關(guān)鍵分子β-catenin及下游相關(guān)的cyclinD1和Bax的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，沙培林組和siSOX9組β-catenin和cyclinD1的蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組，Bax蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，而沙培林+siSOX9組細(xì)胞β-catenin和cyclinD1的蛋白表達(dá)均顯著低于沙培林組和siSOX9組，Bax蛋白表達(dá)顯著高于沙培林組和siSOX9組(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表4)。

圖3 Western blotting檢測(cè)沙培林或siSOX9對(duì)BGC803細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)影響

Fig 3 The effect of Sapylin or siSOX9 on expressions of Wnt/β-catenin related proteins of BGC803 detected by Westernblotting

表4 β-catenin、cyclinD1和Bax的蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab 4 The relative expressions of β-catenin, cyclinD1 and Bax proteins

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與沙培林+siSOX9組比較，#P<0.05。

3 討論

沙培林作為一種抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑，近年在臨床上廣泛應(yīng)用于腹水、癌性胸的治療中，且經(jīng)證實(shí)有確切療效[6]。此外，有臨床試驗(yàn)也表明，沙培林可作為多種實(shí)體腫瘤的化療輔助用藥[7]。但沙培林直接作用于腫瘤細(xì)胞的研究較少。研究[8]表明，沙培林局部應(yīng)用治療腦膠質(zhì)瘤，可通過(guò)對(duì)多種基因的調(diào)控，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和促進(jìn)瘤細(xì)胞的凋亡。沙培林可抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。腫瘤發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素、多階段的復(fù)雜過(guò)程，涉及到抑癌基因失活、癌基因激活等，且腫瘤的分子靶向治療已成為目前的研究熱點(diǎn)。如沙培林結(jié)合分子靶向可進(jìn)一步提高胃癌治療效果，這將給胃癌患者帶來(lái)福音。

SOX9位于17q24.3-q25.1，是SOX基因家族E亞族中的一員，是一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等多種生理及病理過(guò)程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。但其與癌癥間的關(guān)系并不明確，如在肺癌、胰腺癌等腫瘤中表達(dá)異常增加，發(fā)揮癌基因樣作用[9-10]，而在宮頸癌和黑色素瘤中表達(dá)異常降低，充當(dāng)抑癌基因樣作用[11-12]。這提示對(duì)于一些腫瘤SOX9有望成為有效的診療靶點(diǎn)。胃癌中SOX9的研究較少，有研究證實(shí)，胃癌中SOX9表達(dá)升高，沉默其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[5]。由于RNA干擾(RNAi)技術(shù)是一種可在轉(zhuǎn)錄后阻斷基因表達(dá)的新技術(shù)，能高效、特異性地抑制基因表達(dá)，且在基因功能研究、腫瘤治療等方面有廣泛的應(yīng)用[13]。因此，本研究使用RNAi技術(shù)抑制SOX9表達(dá)，以研究其對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。

本研究結(jié)果顯示，沙培林及SOX9 siRNA均可抑制胃癌BGC803細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞活力抑制及凋亡促進(jìn)作用更明顯。這提示沙培林和SOX9 siRNA可能產(chǎn)生疊加作用用于胃癌治療。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路的一個(gè)分支，在進(jìn)化上高度保守，是一個(gè)多作用位點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控信號(hào)通路，其異常激活影響結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14-15]。β-catenin不僅是一種細(xì)胞骨架蛋白，而且是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin積聚到一定程度，可激活Wnt/β-catenin信號(hào)下游靶基因表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)下游有細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1、促凋亡蛋白Bax、c-myc等20多種靶基因，其產(chǎn)物可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等[16]。也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)可降低胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。本研究結(jié)果顯示，沙培林及SOX9 siRNA均可下調(diào)β-catenin和cyclinD1表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，聯(lián)合對(duì)β-catenin、cyclinD1和Bax表達(dá)影響更明顯。

綜上所述，沙培林或SOX9 siRNA均可抑制胃癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，合用對(duì)細(xì)胞影響更明顯，機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)下調(diào)有關(guān)。本研究提示沙培林或SOX9 siRNA聯(lián)合可能是胃癌治療的一個(gè)新的途徑，但還需更多試驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)證實(shí)。