宋 影， 李三強， 田張鈺， 李子昂， 代新華， 王玉東， 蘇立鵬， 宋曉改， 朱文楓， 楊 歡

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，河南 洛陽 471003

急性酒精性肝損傷是指短時間內(nèi)攝入大量酒精，致使血液中酒精濃度超肝臟的代謝能力而引起的肝細胞受損等一系列改變[1]。隨著現(xiàn)代人們交際應(yīng)酬中酒的消耗增多，酗酒人數(shù)逐年增加，酒精性肝病(alcoholic live disease，ALD)的發(fā)病率也在逐年增高，對人們的身心健康造成了嚴(yán)重威脅[2-3]。熱休克蛋白Gp96(glycoprotein of 96 kD，又稱grp94、Hsp90b1)屬于熱休克蛋白90(HSP90)家族的一員，正常條件下定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。其生物學(xué)功能主要為分子伴侶及介導(dǎo)機體免疫應(yīng)答[4]。近年來隨著對Gp96研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)它不僅可以作為免疫佐劑發(fā)揮作用，且具備獨特的抗腫瘤免疫功能，在抗腫瘤免疫及疫苗制備中都具有很大的應(yīng)用。又有文獻報道，Gp96表達水平與腫瘤大小和分化程度呈正相關(guān)，是腫瘤預(yù)后診斷的重要標(biāo)志物[5]。但Gp96在急性酒精性肝損傷過程中的作用并不明確。急性酒精性肝損傷造模與現(xiàn)代人豪飲導(dǎo)致的肝損傷相似[6]，因此本實驗通過小鼠白酒一次性灌胃[7]，檢測不同時間點小鼠肝臟熱休克蛋白Gp96的表達變化，探討Gp96在急性酒精性肝損傷中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料動物：雄性健康清潔級昆明小鼠50只，體質(zhì)量(20±2)g，由河南科技大學(xué)動物實驗中心提供。試劑[8]：紅星二鍋頭白酒(56度)，北京紅星股份有限公司出產(chǎn)；抗Gp96單克隆抗體，Santa Cruz公司生產(chǎn)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；蘇木素伊紅，北京索萊寶科技有限公司；ALT檢測試劑盒，浙江伊利康生物科技有限公司。儀器：CX31RBSF光學(xué)顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；君意300C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；日立全自動生化分析儀7180；ST-250制冰機，北京恒光信息技術(shù)有眼公司；ST40離心機，美國熱電公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備[8]：選取健康昆明雄性小鼠50只隨機分為2組：正常組(n=10)、實驗組(n=40)。正常組小鼠不做處理，實驗組小鼠酒精灌胃(56度紅星二鍋頭，16 ml/kg)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，分別于一次性酒精灌胃后6、12、18和24 h將各組小鼠摘眼球采血，分離血清(5 000 r/min，20 min)，頸椎脫臼處死小鼠并分離提取肝臟。實驗過程中無小鼠死亡。

1.2.2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性的檢測：使用全自動生化分析儀檢測血清中ALT的活性。

1.2.3 HE染色切片觀察[9]：取小鼠肝臟于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋；切片后，將組織切片脫蠟脫水，經(jīng)常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.2.4 肝損傷評分：肝臟HE染色評分標(biāo)準(zhǔn)：脂肪變性：<5%(0分)、5%～33%(1分)、33%～67%(2分)、>67%(3分)；小葉炎癥：無病灶(0分)、<2個病灶/視野(1分)、2～4個病灶/視野(2分)、>4個病灶/視野(3分)；氣泡樣變：無(0分)、少見(1分)、多見(2分)。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測肝組織Gp96的表達量：提取肝臟并用BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)進行蛋白定量，取50 μg樣品，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，硝酸纖維素膜(NC膜)轉(zhuǎn)膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色。β-actin作為內(nèi)參，Gel Pro 4.0軟件分析目的蛋白條帶并計算相對灰度值，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT活性動態(tài)變化小鼠酒精灌胃后，ALT的活性逐漸升高(P<0.05)，18 h后達到最高峰(P<0.01)，之后逐漸降低，24 h接近正常水平(見圖1)。

注：與0時正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 HE染色HE染色鏡下觀察：正常組肝細胞形態(tài)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列均勻，圍繞中央靜脈呈條索狀；實驗組酒精灌胃6 h，肝索紊亂，細胞間隙增大；酒精灌胃12 h，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，細胞出現(xiàn)水腫，甚至壞死，部分區(qū)域炎癥細胞浸潤；酒精灌胃18 h，圍繞中央靜脈周圍出現(xiàn)大量的炎癥細胞浸潤，細胞胞質(zhì)和胞核間出現(xiàn)間隙，壞死明顯；酒精灌胃24 h，組織損傷明顯減輕(見圖2～3)。

2.3 蛋白免疫印記檢測小鼠肝組織中Gp96表達變化酒精灌胃后6 h，小鼠肝組織Gp96蛋白的表達量開始升高，隨著時間延長，Gp96蛋白的表達量持續(xù)升高，18 h達最高值(P<0.01)，之后開始下降，24 h趨于正常，但仍高于正常水平(見圖4)。

注：A：正常組；B：酒精灌胃6 h；C：酒精灌胃12 h；D：酒精灌胃18 h；E：酒精灌胃24 h。

圖2 不同時段小鼠酒精性肝損傷中蘇木素-伊紅染色(HE)結(jié)果(放大200倍)

Fig 2 Results of Hematoxylin-eosin staining (HE) in mice withalcoholic liver injury at differenttime points

注：與0時正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

注：A：蛋白免疫印跡；B：蛋白免疫印跡定量分析。 與0時正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

酒精性肝損傷的發(fā)病原因單一，主要為大量的酒精攝入所致，但發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前尚未完全清楚。其發(fā)病機制主要與氧化應(yīng)激、炎癥細胞因子、乙醛對肝臟的毒性、腸道內(nèi)毒素、遺傳多態(tài)性等因素相關(guān)[10]。其中最關(guān)鍵的損傷機制為氧化應(yīng)激和氧自由基產(chǎn)生過多，從而造成脂質(zhì)大量過氧化，肝細胞出現(xiàn)水腫、凋亡及壞死[11]。HSP90是一類相對分子質(zhì)量約為90 kD的熱休克蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也可從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸出并到達細胞膜[12]。正常生理條件下，Gp96具有分子伴侶功能，促進分泌性蛋白或膜蛋白正確折疊；結(jié)合折疊蛋白中間體，幫助蛋白組裝、胞內(nèi)定位及蛋白分泌、跨膜運輸。同時調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解機器(the ER-associated degradation machinery)降解錯誤折疊蛋白[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Gp96介導(dǎo)機體天然免疫應(yīng)答及特異性免疫應(yīng)答，可以結(jié)合抗原肽，加工提呈腫瘤抗原，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對細胞的生長、發(fā)育、分化及死亡都具有一定的調(diào)節(jié)作用，且從腫瘤中分離出來的Gp96-肽復(fù)合物可以作為一種有效的疫苗發(fā)揮抗腫瘤作用[14-15]。

本研究通過模擬人們豪飲的飲酒方式，構(gòu)建小鼠急性酒精性肝損傷模型，通過血清ALT檢測與組織HE染色結(jié)果，觀察不同時間點小鼠酒精性肝損傷的動態(tài)變化。在此過程中，隨著時間推移，肝臟損傷逐漸加重，Gp96也出現(xiàn)了逐級增高。在18 h肝損傷最嚴(yán)重時，Gp96的表達量也達到峰值，24 h有所降低，與此同時肝損傷也開始明顯減輕。推測Gp96很可能在肝損傷和修復(fù)過程中起著重要作用。小鼠酒精灌胃后18 h內(nèi)，肝細胞損傷逐漸加重，Gp96表達量逐級升高并達到峰值，機體出現(xiàn)了明顯的應(yīng)激反應(yīng)。Gp96高表達發(fā)揮分子伴侶功能保持細胞蛋白構(gòu)象穩(wěn)定，并與細胞內(nèi)的其他肽類蛋白質(zhì)結(jié)合，參與細胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程，最終阻止或減少細胞凋亡發(fā)生；應(yīng)激條件下，其作為應(yīng)激蛋白在細胞損傷時可以保持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保護細胞免受細胞毒性效應(yīng)和應(yīng)激的損傷[12]。大量研究已證實，氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化在酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。當(dāng)大量飲酒后，乙醇及其代謝產(chǎn)物導(dǎo)致肝細胞損傷，肝臟枯否細胞活化，誘導(dǎo)CYP2E1的表達，并使其分泌以TNF-α增加為主的各種細胞因子，促進活性氧(ROS)產(chǎn)生增加，造成氧化應(yīng)激；ROS作為第二信使活化NF-κB，從而發(fā)揮其對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。又有文獻報道，NF-κB可以通過與Gp96啟動子結(jié)合，激活Gp96轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)Gp96表達，促進肝細胞增殖，抑制凋亡，促進細胞周期從靜息期向分裂期的轉(zhuǎn)化[16]。因此，隨著酒精性肝損傷的加重，Gp96顯著升高，可能與其抗凋亡和促進細胞增殖的作用相關(guān)。因此，隨著酒精性肝損傷的加重，Gp96顯著升高，可能與其抗凋亡和促進細胞增殖的作用相關(guān)。

綜上所述，急性酒精性肝損傷過程中，隨著肝細胞損傷的逐漸加重，Gp96表達量不斷升高，當(dāng)表達量到達峰值后，肝細胞損傷有所減輕，提示Gp96具有促進肝損傷后修復(fù)的重要作用。但Gp96在急性酒精性肝傷中的具體作用機制目前尚不清楚，今后的研究中將做進一步研究。