陳 鵬，張文斌，王 瑤，焦方舟，陳 倩，龔作炯

武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科，湖北 武漢 430060

NCM460細(xì)胞為人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞，腸黏膜上皮作為腸道的主要屏障，一直處于動(dòng)態(tài)更新的狀態(tài)中，保持腸上皮細(xì)胞數(shù)目相對(duì)恒定來(lái)維持黏膜屏障的正常功能。脂多糖刺激人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460后，其增殖速度受到抑制，脂多糖在不同處理濃度和不同處理時(shí)間條件下處理NCM460細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞的凋亡，且隨著脂多糖處理時(shí)間與處理濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也有所提高，但脂多糖引起NCM460細(xì)胞的凋亡機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[1-2]。在急性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中，目前多數(shù)學(xué)者支持“兩次打擊”學(xué)說(shuō)，一是由病毒直接或間接(免疫反應(yīng))所致原發(fā)性損傷，二是以內(nèi)毒素-細(xì)胞因子軸-肝損傷學(xué)說(shuō)為核心的繼發(fā)性損傷[3]。目前認(rèn)為內(nèi)毒素血癥與肝細(xì)胞凋亡可互為因果，從而對(duì)肝病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響。研究顯示，肝衰竭患者存在著嚴(yán)重的腸道微生態(tài)失衡，腸道厭氧菌如雙歧桿菌等顯著減少，腸桿菌科細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，腸道定植抗力下降，腸壁屏障功能受損，導(dǎo)致腸道細(xì)菌(包括內(nèi)毒素及腸源性細(xì)胞因子等)移位[4-6]。脂多糖作為最主要的內(nèi)毒素，不僅僅通過(guò)肝腸靜脈進(jìn)入體內(nèi)損傷各種靶器官，還能直接損傷腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的凋亡。保護(hù)腸黏膜可能成為治療急性肝衰竭的一個(gè)策略。有研究報(bào)道，谷氨酰胺對(duì)腸道黏膜屏障具有保護(hù)作用，但該藥對(duì)腸道細(xì)胞作用的保護(hù)機(jī)制尚未完全清楚[7-9]。本研究選取NCM462細(xì)胞進(jìn)行體外探討谷氨酰胺對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，為急性肝衰竭等影響腸道上皮細(xì)胞損傷的治療提供新方法與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器NCM460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；脂多糖、L-谷氨酰胺顆粒均購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、Phsphate Buffered Saline(1×)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sera Pro公司；胰酶Trypsin購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；RIPA裂解液、β-actin、HRP標(biāo)記驢抗山羊、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Therm公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司；PVDF膜0.45 μm購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；VICTOR3 1420型酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭PerkinElmer公司；電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像分析儀購(gòu)自德國(guó)EPSON公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCM460細(xì)胞，吸除掉原有培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，再用PBS清洗后加入胰蛋白酶(能覆蓋細(xì)胞)消化處理5 min。待細(xì)胞都變圓后將胰酶吸出培養(yǎng)基。然后加入新鮮配制的培養(yǎng)基(RPMI-1640+質(zhì)量濃度為100 g/L FBS+質(zhì)量濃度為10 g/L P/S)，輕輕吹打細(xì)胞，懸浮細(xì)胞，配制成的細(xì)胞懸液的濃度為3×105個(gè)/ml，按每孔6×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔加入2 ml培養(yǎng)體系，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，把培養(yǎng)的NCM460細(xì)胞分為正常組、脂多糖組、谷氨酰胺組。脂多糖組加入濃度為5 μg/ml的0.5 ml脂多糖溶液和0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，谷氨酰胺組加入濃度為12 mmol/L的0.5 ml谷氨酰胺和5 μg/ml的0.5 ml 脂多糖溶液，正常組加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞用于Western blotting檢測(cè)三組細(xì)胞中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞線粒體凋亡途徑蛋白取適量各組處理24 h后的NCM460細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制12% SDS-PAGE凝膠，每孔加樣50 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉37 ℃搖床封閉1 h；洗膜，孵一抗，4 ℃搖床過(guò)夜，洗膜，室溫下?lián)u床孵二抗1 h，洗膜，采用Odyssey系統(tǒng)掃膜，分析Bcl-2、Bax及Cyt-c的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況首先收集各組細(xì)胞：用PBS洗滌6孔板中的細(xì)胞1次，加入胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓且有部分細(xì)胞懸浮，將胰酶吸出，加入PBS洗滌。用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮。收集于流式管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗滌細(xì)胞：加入4 ℃預(yù)冷的PBS 3 ml將細(xì)胞重懸，1 500 r/min離心5 min，棄上清。沉淀用200 μl的Binding Buffer重懸。其次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記：先加入5 μl Annexin V-FITC混勻，再加入5 μl Propidium Iodide，混勻。室溫下避光反應(yīng)10 min。最后將準(zhǔn)備好的裝滿NCM460細(xì)胞流式管進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)：Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FITC通道(FL1)檢測(cè)，PI紅色熒光通過(guò)PI通道(FL2)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀參數(shù)如下：激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)FL1[Em=(525±20) nm]；FL2[Em=(585±21) nm]。用FlowJo軟件分析細(xì)胞不同狀態(tài)(主要是早凋、晚凋)的比例及數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 NCM460細(xì)胞線粒體凋亡途徑蛋白表達(dá)情況如圖1所示，Western blotting結(jié)果顯示,與正常組相比，脂多糖組中Bax、Cyt-c蛋白的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)較正常組降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax值較正常組下降；而給予谷氨酰胺處理后，谷氨酰胺組Bax、Cyt-c蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平則顯著高于脂多糖組(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值較脂多糖組也顯著升高。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡率如圖2、表1所示，各組細(xì)胞處理24 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡率，脂多糖組細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，其早期凋亡率及晚期凋亡率均明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；谷氨酰胺組細(xì)胞的凋亡較脂多糖組減輕，其早期凋亡率及晚期凋亡率均低于脂多糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組NCM460細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Fig 1 Related proteins of mitochondrial apoptotic pathway in NCM460 cells of each group detected by Western blotting

圖2 三組NCM460細(xì)胞流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Results of apoptosis in NCM460 cells of three groups detected by flow cytometry

Tab 1 Apoptosis rate of NCM460 cells of three groups

注：與正常組比較，*P<0.05；與脂多糖組比較，#P<0.05。

3 討論

谷氨酸是人體中最豐富的游離氨基酸，體內(nèi)大部分的谷氨酰胺都會(huì)在腸道內(nèi)代謝，是腸道細(xì)胞利用的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在維持腸道生理和對(duì)抗多種腸道疾病的治療中起著重要的作用[10]。在腸道生理中，谷氨酰胺具有促進(jìn)腸細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)緊密連接蛋白，抑制促炎癥信號(hào)通路，并在正常和病理?xiàng)l件下保護(hù)細(xì)胞抵抗細(xì)胞的凋亡[8，11-12]。在一項(xiàng)谷氨酰胺強(qiáng)化的早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充谷氨酰胺能夠改善肝移植大鼠腸黏膜的血供，降低腸黏膜丙二醛的產(chǎn)生，有助于腸道正常分泌SIgA，抑制腸黏膜巨噬細(xì)胞NF-κB活性，減少TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而改善肝移植腸黏膜損傷情況，抑制腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位[13]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠谷氨酰胺的缺乏則可增加腸上皮細(xì)胞的凋亡[14]。這些研究均表明谷氨酰胺對(duì)腸道黏膜具有重要的保護(hù)作用。

線粒體凋亡途徑是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一種重要方式，主要由Bcl-2家族蛋白調(diào)控，包括抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)和促進(jìn)凋亡的Bcl-2家族蛋白(如BMF、Bid、Bax和Bak)[15]。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2表達(dá)增加則能夠通過(guò)降低線粒體膜的通透性、抑制線粒體去極化及Cyt-c釋放發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則可促進(jìn)Cyt-c釋放，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡作用[16-17]。KALLWEIT等[18]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以預(yù)防腸上皮細(xì)胞在受熱損傷和氧化損傷時(shí)細(xì)胞的凋亡，一方面是通過(guò)增強(qiáng)保護(hù)性熱休克蛋白的表達(dá)，另一方面是通過(guò)降低CC-3(cleaved caspase-3)的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。他們認(rèn)為谷氨酰胺并不是直接降低CC-3的表達(dá)而直接發(fā)揮預(yù)防凋亡的作用，可能存在另外的中間體來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。而在線粒體凋亡途徑中，釋放到細(xì)胞漿的Cyt-c在dATP存在的條件下通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終能激活Caspase-3，形成CC-3，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。基于這些研究基礎(chǔ)我們推測(cè)線粒體凋亡途徑可能參與了腸上皮細(xì)胞的凋亡，結(jié)合前言中所講述的急性肝衰竭病程中出現(xiàn)的腸道功能障礙，影響急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展，谷氨酰胺可能通過(guò)線粒體凋亡抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡，改善腸道的功能而進(jìn)一步改善急性肝衰竭的進(jìn)展，為谷氨酰胺治療急性肝衰竭提供新的理論依據(jù)。

我們使用谷氨酰胺作為干預(yù)劑作用于脂多糖誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷凋亡模型的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺治療組NCM460凋亡細(xì)胞較脂多糖組明顯減少，且NCM460細(xì)胞線粒體凋亡途徑蛋白Bax、Bcl-2、Cyt-c在各組間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脂多糖組Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2/Bax值較正常組下降；而與脂多糖組相比，谷氨酰胺組Bax、Cyt-c蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)則升高，Bcl-2/Bax值較脂多糖組也明顯升高。這表明谷氨酰胺可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡，并通過(guò)抑制NCM460細(xì)胞線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)其與抑制凋亡的作用。本文選取NCM460細(xì)胞作為研究對(duì)象在細(xì)胞層面探討谷氨酰胺對(duì)腸道細(xì)胞的影響，首次報(bào)道谷氨酰胺通過(guò)抑制線粒體凋亡途經(jīng)保護(hù)腸道細(xì)胞，與既往研究報(bào)道在保護(hù)作用方面一致，但作用機(jī)制不同，補(bǔ)充了谷氨酰胺保護(hù)腸道細(xì)胞的理論依據(jù)。